分光光度法测定金荞麦(-)表儿茶素含量的方法研究 毕业论文

'皖西学院本科毕业论文（设计）分光光度法测定金荞麦(-)表儿茶素含量的方法研究姓名：学号：院（系）：生物与制药工程学院专业：食品质量与安全校内指导老师：职称：第7页 皖西学院本科毕业论文（设计）目录摘要、关键词…………………………………3前言……………………………………………3一、材料与方法………………………………3二、结果与分析………………………………4三、讨论与结论………………………………6参考文献………………………………………6致谢……………………………………………7第7页 皖西学院本科毕业论文（设计）分光光度法测定金荞麦(-)表儿茶素含量的方法研究摘要：为建立香荚兰素-盐酸分光光度法对表儿茶素含量的测定方法，实验分别以乙醇和水作溶剂，在34.79～208.74ug范围内取样置50ml容量瓶测定，结果发现：①以乙醇作溶剂时，测定波长为508nm，1%香荚兰浓盐酸添加量应超过40ml(CV≤1.86%)，测定时间以40min后为宜(CV≤2.65%)，标准曲线线性关系(R＝0.9993)与精确度(CV＝2.66%)、准确度(p＞0.05)良好。②以水作溶剂时，测定波长为504nm，显色反应不稳定，标准曲线线性关系(R＝0.9881)也较一般。③采用乙醇作溶剂时，测得金荞麦块根中(-)表儿茶素类物质含量占干物质的2.22%(CV≤3.90%)，该法操作简便，灵敏度高，重现性好。关键词：(-)-表儿茶素；分光光度法；含量测定StudyontheDeterminationofEpicatechininFagopyrumDibotrysbySpectrophotometryAbstract:Inordertoestablishaspectrophotometricdeterminationofthevanillin-hydrochloricacidmethodtodeterminethecontentofepicatechin,thesamplesrangingfrom34.79ugto208.74ugcontainedinthe50mlvolumetricflasksaredeterminedwithabsolutealcoholandwaterassolventrespectively.Theresultsshowthat:(1)Whenabsolutealcoholisusedasdissolvent,thedetectionwavelengthisat508nm,theadditionofthe1%vanillin-hydrochloricacidshouldexceed40ml(CV≤1.86%),andtheoptimumdetectionperiodis40min(CV≤2.65%).Meanwhile,thelinearrelationofthestandardcurve(R＝0.9993),thedegreeofprecision(CV＝2.66%)andtheaccuracyofmeasurement(p＞0.05)showgood.(2)Whenwaterisusedasdissolvent,thedetectionwavelengthisat504nm,butthechromogenicreactionisnotstableandthelinearrelationofthestandardcurveisratherordinary.(3)Whenabsolutealcoholisadoptedasdissolvent,thecontentsofepicatechininfagopyrumdibotrys’tuberousrootaccountfor2.22%ofthedrymattercontent(CV≤3.90%).Therefore,thisisaresearchmethodwithconvenientoperation,highsensibilityandgoodreproducibility.Keywords:epicatechin;spectrophotometry;determination前言金荞麦等一些药用植物根茎、果实中含有一类原花色素缩合性单宁混合物，其主要基本单元为(-)-表儿茶素[1]，表儿茶素具有显著的抗癌，抑制肿瘤细胞肺侵袭和转移，以及消炎抗菌等重要作用，是多种有效药物的主要成分之一[2,3]。目前，有关表儿茶素含量测定的方法包括高效液相色谱(HPLC)法[4,5]、薄层层析法[6]、毛细管电泳-电化学法[7]等。但这些方法所需仪器昂贵、操作要求高[8]。实际上，简捷方便的分光光度法在表儿茶素的同分异构体——儿茶素含量的测定上已取得一定进展。如张佳等比较了香荚兰素-盐酸分光光度法与HPLC法对锁阳中儿茶素的含量测定效果，发现两种方法间差异不明显[9]，但实验并未就分光光度法本身的测定条件进行研究。其他如赵先明探讨了用香荚兰素-硫酸分光光度法检测茶叶中儿茶素的含量[10]，但未考虑硫酸具有强氧化性，容易对试验仪器和操作人员造成严重伤害；魏毅等在505nm波长处，通过香荚兰素-盐酸分光光度法测定儿茶素含量时，认为以水作溶剂吸收度稳定性与可操作性都优于以乙醇作溶剂[11]，但未考虑改变溶剂的极性，可能会使吸收带的最大吸收波长发生变化。鉴于此，本实验以(-)-表儿茶素为标样，优化设计香荚兰素-盐酸分光光度法的测定条件，以期建立(-)-表儿茶素含量的快速高效测定标准。1材料与方法1.1仪器与材料TU-1901双光束紫外可见分光光度计(北京普析通用仪器有限责任公司)、202-1型电热恒温干燥箱(上海浦东英丰科学仪器有限公司)、HH-2/HH-4数显恒温水浴锅(江苏省金坛市荣华第7页 皖西学院本科毕业论文（设计）仪器制造有限公司)，(-)表儿茶素(中国药品生物制品检定所,98%)，无水乙醇、盐酸、香荚兰素等皆为分析纯，金荞麦块根从大别区野外采集。1.2实验方法(1)标准液与显色剂的配置：精密称取(-)表儿茶素17.75mg置于50ml容量瓶中，加乙醇至刻度，溶解摇匀为标准液待用；称取10g香荚兰素溶于1000mL浓盐酸中，配置成1%香荚兰浓盐酸显色剂，现配现用。(2)不同溶剂中最大吸收波长的确定：吸取标准液500ul置于50ml容量瓶，以水为溶剂，加10ml，用1%香荚兰浓盐酸定容，摇匀，40min后以水代替标准液作空白对照，于300~700nm扫描，确定测定波长为λ1。同理，以乙醇为溶剂，确定测定波长为λ2。(3)标准曲线的绘制：分别精密吸取标准液100、200、300、400、500、600ul于50ml容量瓶中，加水10ml，用1%香荚兰浓盐酸定容，摇匀，40min后测定以水为溶剂的(-)表儿茶素吸光度，并绘制标准曲线。同理，绘制以乙醇为溶剂时的标准曲线。(4)稳定性实验：取标准液400ul共2份，分置于2个50ml容量瓶中，分别以水或乙醇为溶剂，加10ml，用1%香荚兰浓盐酸定容，摇匀，在0、20、40、60、80、100、120nim时测定其吸光度，通过稳定性分析确定适宜溶剂及显色反应时间。(5)显色剂用量的测定：取标准液400ul，分别加入不同体积的1%香荚兰浓盐酸，适宜溶剂定容，摇匀，适宜时间内测定其吸光度。(6)精密度实验：取标准液400ul共5份，加入适宜的显色剂量，以适宜溶剂定容，适宜时间内测定其吸光度。(7)金荞麦中(-)表儿茶素的含量测定：精密称取金荞麦块根干燥粉碎物3g，用50%乙醇45ml冷浸16h，置70℃水浴回流1h，放冷后补充回流乙醇损耗量至45ml，过滤后取0.1ml于50ml容量瓶中，加乙醇10ml，用1%香荚兰浓盐酸定容，摇匀，40min后测定(-)表儿茶素吸光度。2结果与分析2.1光谱特性的结果与分析在最大吸收波长确定实验中，以水为溶剂时，(-)表儿茶素的最大吸收波长为504nm；以乙醇为溶剂时，(-)表儿茶素的最大吸收波长为508nm。进一步在标准曲线的绘制实验中发现，在同一溶剂中，不同浓度的(-)表儿茶素溶液经显色反应后，产生的显色物质波形稳定，波峰基本一致。在水溶剂中，显色物质的最大吸收峰都在504nm(图1)；在乙醇溶剂中，显色物质的最大吸收峰都在508nm(图2)。因此，实验分别选择在504、508nm处测定(-)表儿茶素溶于水或乙醇的吸光度。2.2标准曲线的结果与分析表1不同测定条件下表儿茶素各测定浓度的吸光度观测[A]测定条件标准液(ul)100200300400500600测定液标样浓度(ug/ml)0.69581.39162.08742.78323.4794.1748水溶剂、504nm吸光度0.07800.15720.24150.33900.47890.4903第7页 皖西学院本科毕业论文（设计）乙醇溶剂、508nm吸光度0.13290.30780.47360.62050.76140.9329以吸光度为纵坐标，测定液标样浓度为横坐标(表1)，，得(-)表儿茶素在水溶剂、504nm波长处的标准曲线为Y=0.1283x－0.0149，R=0.9881；在乙醇溶剂、508nm波长处的标准曲线为Y=0.2262X－0.0126，R=0.9993。虽然在水溶剂、504nm波长条件下，相关系数R稍低，但鉴于《实验室质量控制规范－食品理化检测》规定：对于筛选方法，线性回归方程的相关系数不应低于0.98，对于确证方法，相关系数不应低于0.99[12]。故上述标准曲线均为合理。2.3溶剂与反应时间的结果与分析表2不同测定条件下显色反应时间对表儿茶素吸光度的影响[A]测定时间(min)020406080100120水溶剂、504nm0.68040.51210.44080.36860.32270.28850.2591乙醇溶剂、508nm0.74450.66140.61390.57620.57790.58090.5909由表2结合稳定性实验可见，(-)表儿茶素在1%香荚兰浓盐酸显色剂中显色很快，其中以水为溶剂时，随着时间的推移，吸光度逐渐变浅，表明以水作溶剂显色反应呈现不稳定性；以乙醇作溶剂时，0～120min内变异系数(CV)为10.04%，20～120min内CV为5.51%，40～120min内CV为2.65%，60～120min内CV为1.13%。结合《实验室质量控制规范－食品理化检测》相关规定，该被测组分含量在CV为7.5%时视同稳定有效[12]，故用乙醇作溶剂时，在(-)表儿茶素测定液中加入%香荚兰浓盐酸20min后，显色反应稳定，反应液具有较大的吸光度。2.4显色剂用量的结果与分析表3不同显色剂用量对表儿茶素吸光度的影响显色剂用量(ml)283236404448吸光度(A)0.41460.47120.53520.58550.60740.5917测定液标准曲线推导浓度(ug/ml)1.88862.13882.42182.64412.74092.6715由测定液标样的实际浓度(2.7832ug/ml)结合表3经标准曲线推导出的测定液浓度可见，显色剂用量以不少于40ml为宜。进一步分析，显色剂用量≥36ml时，CV为5.26%；而显色剂用量≥40ml时，CV为1.86%。故确定显色剂适宜用量为40ml。2.5精密度检查的结果与分析由图3可见，在精密度实验中经5次测定，各波长处吸光度大小相对一致。进一步对508nm波长的吸收度进行分析(见表4)，5次测定液标准曲线平均推导浓度为2.8209ug/ml，CV为2.66%，精确度高；经单个平均数的显著性检验，其与测定液标样的实际浓度2.7832ug/ml间差异不显著(p＞0.05)，即两者之间的差异属随机误差，准确度高，该测定方法可行。表4精密度测定情况分析表项目ⅠⅡⅢⅣⅤ平均吸光度(A)0.62410.63270.64890.61860.60312.81482.85282.92442.79052.72192.8209±0.0750第7页 皖西学院本科毕业论文（设计）测定液标准曲线推导浓度(ug/ml)2.6金荞麦(-)表儿茶素含量测定表5金荞麦(-)表儿茶素乙醇提取物含量测定表项目ⅠⅡⅢ平均吸光度(A)0.64050.64190.6861乙醇提取物(-)表儿茶素含量(ug/ml)2.88732.89353.0889金荞麦块根(-)表儿茶素含量(%)2.172.172.322.22±0.09由表5可见，金荞麦块根(-)表儿茶素含量占干物质含量的2.22%，CV为3.90%，组内差异不显著。3讨论与结论综合上述，采用分光光度法测定(-)表儿茶素含量时，可用乙醇作溶剂，在508nm波长处测定吸光度，测定时间以显色反应发生后40min为宜。采取该方法测定金荞麦块根中(-)表儿茶素含量为其块根干物质含量的2.22%，该操作简便，灵敏度高，重现性好。实验中水的测定波长稍低于乙醇，这是因为水是极性溶剂，乙醇是半极性溶剂，当溶剂的极性增加时，R带蓝移，吸收峰向短波移动[13]。此外，实验中显色反应时间为40min，与黄河宁等[14]测定茶制品中儿茶素含量反应时间为15h差距较大。这主要是因为香荚兰素与儿茶素反应生成羟醛缩合产物缓慢且不够稳定[15]，而显色剂用量主要又取决于有色化合物的稳定性，对稳定性较好的化合物，显色剂一般过量30%～50%，对稳定性较差，显色剂一般过量10倍以上[11]；只有显色剂过量才能确保儿茶素充分反应，以提高测试结果的精确度[14]。故本实验中香荚兰素与儿茶素物质的量之比非常大，不但保证了反应加快，且保证了缩合产物的稳定性。值得注意的是在金荞麦取样测定时，其块根提取物中除含有(-)表儿茶素外，还含有少量(+)儿茶素，以及二者的二聚体和没食子酸酯[1]，而用香荚兰素比色法测定时，儿茶素类分子中的间苯二酚或间苯三酚与香荚兰素发生缩合而形成有色的正碳离子，此反应的化学物质基础是(-)表儿茶素和(+)儿茶素，所以用(-)表儿茶素或(+)儿茶素作标样时，所测物质属总儿茶素含量[16]。因此我们在(-)表儿茶素的含量测定上，要充分考虑(+)儿茶素的存在，尽管两者的理化学性质和药用功能基本相同。参考文献[1]姚荣成,黄梅芬,吴友仁等.云南产金荞麦根茎抗肿瘤有效部位的化学研究[J].云南植物研究,1989,11(2):215-218.[2]艾群,王斌,王国清.金荞麦制剂的抑菌研究[J].黑龙江医学,2002,26(9):666.[3]Pui-KwongChan.金荞麦体外抑制肿瘤细胞生长的研究[J].中西医结合学报,2003,1(2):128-131.[4]戴宏芬,赖志勇,李建光等.黄皮和杨梅果肉中绿原酸、表儿茶素及芦丁含量的HPLC测定[J].华中农业大学学报,2008,27(3):445-449.[5]何美珊,钱炳辉.王兆龙等.HPLC法测定金荞麦中(-)-表儿茶素含量[J].中草药,2005,36(3):441-442.[6]郭玉蓉,韩舜愈,刘鹏等.荞麦黄酮类化合物的提取分离及结构鉴定[J].食品科学,2004,25(11):131-134.[7]侯建霞,汪云,程宏英.毛细管电泳－电化学检测测定荞麦中表儿茶素、芦丁、槲皮素的含量[J].食品科技,2007,(2):241-244.[8]崔恩惠,方亮,李维林等.响应面法优化分光光度法测定天然维生素E[J].食品工业科技,2010,31(2):324-328.[9]张佳,王阳,王永刚等.锁阳中儿茶素含量的测定及方法比较[J].食品工业科技,2010,31(8):343-344,347.[10]第7页 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