现代生物技术在分子微生物生态学中的应用

#164#国外医药抗生素分册2006年7月第27卷第4期文章编号:1001-8751(2006)04-00164-07现代生物技术在分子微生物生态学中的应用邓小宽张新宜田敏(中国医药集团四川抗菌素工业研究所有限公司,成都610051)摘要:微生物生态学研究中采用的分子生物学方法主要有标记核酸探针技术、基于PCR的分析方法、梯度凝胶电泳方法、磷脂脂肪酸谱图分析方法、rRNA序列同源性分析方法以及质粒、编码特殊蛋白质和低分子量RNA基因分析等。这些技术方法的采用在微生物生态学研究中取得了重大的突破,使得对某些微生物的研究成为可能,并在分子水平上阐述了其生态机制。关键词:分子微生物生态学;现代生物技术;核酸杂交;PCR-RFLP;PCR-SSCP;PCR-DGGE;PLFA;核糖体RNA基因;中图分类号:Q81,Q93811文献标识码:A微生物作为自然界生物系统中的重要一员,就其座DNA成分的存在等。利用DNA和RNA探针检种类和数量而言,是地球上仅次于昆虫的第二大类生测、跟踪环境中特定的基因或DNA序列及其宿主微物。由于频繁的遗传物质交换,微生物群落遗传稳定生物,使得核酸杂交技术在微生物生态领域发挥了重性相对较差,这是导致目前所建立的微生物分类系统要的作用。不同的微生物类群都各自携有某些特殊的还不十分完善的主要原因。加上微生物生物代谢途径遗传信息,我们可以从某一个微生物有机体的基因组的多变性和复杂性,大量微生物的不可培养性给传统中检测到特定的基因,也能从许多微生物有机体的基微生物生态学研究带来了相当大的困难。自1953年因组混合物中检测到同样的基因,从而检测到携有该以来,许多分子生物学研究方法和理念被应用到微生特定基因的微生物种的存在。物生态学研究中,使关于微生物多样性、微生物种群动111分子杂交及同源性分析力学、重要基因定位、表达调控及其基因水平转移对生分子杂交及同源性分析(DNA-DNA/DNA-RNA)态系统的影响等方面取得了长足的进展,极大地推动方法是分子微生物生态学发展初期采用的主要研究方[1]了分子微生物生态学的发展。法,是研究微生物区系系统发育关系、微生物鉴定、微分子微生物生态学就是运用分子生物学的方法和生物物种之间同源性等分子微生物生态学研究方法的技术,在基因水平上估计种的个体丰度,查明种的变异基础。DNA-DNA/DNA-RNA杂交包括整个基因组的情况以及探究群落中微生物间相互关系的科学。生物重组。它提供了检测核苷酸序列相似性的一种通用方技术的应用,使我们不必培养微生物,而直接通过对环法。由于起源不同的两条DNA单链之间重组是很难境中遗传物质的研究来达到目的,它为微生物生态学配对的,最多不会超过20%的核苷酸之间会形成双的研究开辟了新的途径,本文将就分子微生物生态学链,因此可以利用DNA相似值来估计序列的相似程所涉及主要研究方法以及未来研究热点等加以讨论。度。研究表明,DNA-DNA杂交在种水平上的分类是1核酸杂交非常有用的,但不能用来测定种间或亲缘关系更远的核酸杂交技术为微生物生态学的研究提供了一种微生物。强有力手段,通过它可获得众多传统技术难以培养或112标记核酸探针技术鉴定的自然种群的DNA信息,在环境中跟踪特定的由于某个基因对于特定的微生物种可能是独特基因及其宿主微生物,并且可以在同一时间研究多种的,在这种情况下,这一DNA顺序就有利于检出这类微生物。核酸杂交技术较早时常被用于异源双链核酸特定的微生物体。或者这个基因可能编码某一代谢途分子的分析以探讨两种核酸分子之间序列的相似情径中独特的酶,用该序列构建出的基因探针就有可能况,通过电子显微镜观察杂合分子上的单链(非互补)指示外部环境中一类微生物的存在。和双链(互补)区域,通过异源双链核酸分子杂交分析11211荧光原位杂交检测内含子在基因上的位点、基因重排,以及证实可转荧光原位杂交(FISH)技术提供微生物形态学、数\n现代生物技术在分子微生物生态学中的应用邓小宽等#165#量、空间分布与环境方面的信息,使人们可以对自然生以荧光标记的特异多肽为探针,通过PNA在原位与样[2]境中的微生物进行动态地观察和鉴定。FISH技术品中的DNA结合,对样品中的微生物进行鉴定及原是根据已知微生物在不同分类级别上种群特异的位分析。PNA探针与DNA探针相比,PNA具有探针DNA序列,以利用荧光标记的特异寡聚核苷酸片段作短,与样品中DNA杂交速度快,而且杂交时不依赖于为探针,与环境基因组中DNA分子杂交,检测该特异缓冲液盐的浓度等优点,并且PNA的两性电解质骨架微生物种群的存在与丰度。该方法的特点是可以进行使其更适合于原位杂交。该方法代表了微生物区系遗样品的原位杂交,应用于环境中特定微生物种群鉴定、传信息、微生物功能和代谢方式多样性之间相互关系[9]种群数量分析及其特异微生物跟踪检测等。研究方法的发展趋势。FISH技术采用固定细胞,利用16S或23SrRNA2基于PCR的研究方法与荧光标记的特异性寡核苷酸探针杂交,再由扫描共PCR技术是1985年由Mullis发明的一种聚合酶焦激光显微镜观察固定的细胞。由于杂交的是整个细链式反应技术,主要特点是能够在短时间内在实验室胞,省去了提取DNA,PCR扩增以及克隆等步骤。条件下人为地控制并特异扩增目的基因或DNA片[3]Connally等应用时段荧光显微技术(TRFM)检测环段,使目的基因及其环境样品中的微量微生物基因得境微生物样品,解决了藻类以及矿物颗粒的自荧光对到无限的扩增,为分子微生物生态学的研究提供了非[4]免疫荧光以及FISH的干扰。Perry-O.keefe等应用常方便的手段。4种DNA探针的M-FISH对铜绿假单胞菌、金黄色葡211PCR-RFLP及AFLP方法萄球菌和大肠埃希菌进行了检测,采用了多波峰的滤限制性片段长度多态性技术(RFLP)是根据不同[5]镜,可以同时观察M-FISH情况。Sekiguchi等研究生物个体或种群之间DNA片段酶切位点有所差异的了UASB反应器中高温和中温颗粒污泥的厌氧微生特点,利用限制性内切酶进行消化,产生长短、种类、数物群落,揭示了微生物的空间分布和多样性,并对其原目不同的限制性片段,然后对这些特定DNA片段的位生理学和功能进行了探讨。限制性内切酶产物进行分析,根据特定的限制性酶谱FISH技术具有快速、准确、原位等诸多优点,在环图可对群落中的微生物加以区分。但是该技术需要依境样品中微生物多样性,污水处理相关微生物多样赖Southernblot技术,需要克隆基因探针,DNA的用[6][7]性,内共生微生物多样性以及医学微生物口腔、量较大且纯度要求很高,因此应用受到了一定限制。[8]肠胃、呼吸道菌群多样性研究中得到了广泛的应将PCR应用于RFLP的PCR-RFLP技术则克服用。但FISH技术的应用要受到环境样品微生物的生了这一缺点。PCR-RFLP法是将PCR引物中的一条理状态的影响,如芽孢、放线菌及休眠时期细胞的细胞加以荧光标记,反应后用合适的限制酶切、电泳分析,膜通透性降低,都会影响群落中部分种属丰度的正确再根据片断的大小不同以及标记片断种类和数量的不估计,而且不能检测出环境样品中的未知种属。同分析群落的结构及组成多样性。此方法对微生物遗11212发光酶标记技术传多样性尤其是微生物的种以下分类具有重要意[10]发光酶是生物体内催化发光反应的酶,一般将编义。码萤火虫发光酶的基因(lux)作为实用的标记基因。扩增片段长度多态性(AFLP)是PCR和RFLP技这一标记基因对于跟踪和检测释放至海洋中的生物尤术发展的一种新型DNA指纹技术。该技术利用了为重要,因为它可以排除来自海洋中发光细菌的干扰。RFLP的可靠性和PCR的高效性,对基因组DNA酶其主要缺陷是反应底物萤火虫荧光素价格昂贵,非每切片段进行选择性扩增,其实质是利用2种以上的酶个实验室都能使用。发光酶标记微生物在微生物分子切割DNA形成不同酶切位点的限制酶切片段,在所生态学研究中一般采用DNA探针结合PCR技术检测得的酶切片段上加上双链人工接头,作为PCR扩增的lux基因片段,采用摄影胶卷和X-射线胶片检测,发模板。AFLP对PCR的引物作了修饰,将引物与酶切光光度计测量和CCD照相机成像检测等方法。生物片段识别序列结合起来,核心序列与人工接头互补,从发光酶基因标记系统在土壤微生物的原位定量研究和而实现选择性扩增。扩增产物经变性聚丙烯酰胺凝胶[11]GMMs的环境监测与风险评估的工作中,其应用的意电泳分析,显示扩增片段长度多态性。AFLP技术义尤为重要。通过特异性PCR引物设计和内切酶组合的选择,来调11213荧光蛋白质-核苷酸特异探针原位杂交整AFLP图谱中限制性片段的适宜数目,具有一定的荧光蛋白质-核苷酸特异探针原位杂交(PNA)灵活性。严格的PCR条件和高分辨率的聚丙烯酰胺\n#166#国外医药抗生素分册2006年7月第27卷第4期凝胶电泳,使AFLP重复性好,分辨率高。而且AFLP银染方法与PCR-SSCP结合,尤其是直接使用溴化乙标记具有比RFLP、RAPD标记更为可靠、有效地揭示锭染色方法的应用,使得该方法大大简化。微生物多态性水平的能力,为研究微生物属以下物种PCR-SSCP技术的另一个重要进展就是RNA单之间的亲缘关系,乃至菌株间差异提供了非常有效手链构象多态性(RNA-SSCP)分析技术的出现。由于段。RNA有着更精细的二级和三级构象,这些构象对单个212PCR-RAPD方法碱基的突变很敏感,而且RNA不易结合成双链,可以随机引物扩增多态性(RAPD)方法是以人工随机较大量的进行电泳,有利于进行溴化乙锭染色。但该合成的DNA分子为引物,以基因组DNA为模板,通方法增加了一个反转录过程,还需要一个较长的引物,过PCR技术对多态性DNA片段随机合成。如果某一内含有启动RNA聚合酶的启动序列,从而相对地增引物分子与某一片段DNA模板具有互补的核酸序加了该方法的难度。列,该引物分子就会结合到单链的DNA模板上,合成PCR-SSCP技术不但可以用于微生物的快速诊[15]一段新的互补DNA链。对整个基因组的DNA分子断,还可进行微生物的分型。Satheesh等用PCR-而言,某一引物可能会与单链DNA的许多位点结合。RFLP及PCR-SSCP分析了来自41株10种不同血清然后对扩增产物进行电泳,用溴化乙锭染色,就可以直型沙门菌的groEL基因,分别得到3种RFLP带型和接检验出被扩增的DNA多态性。该方法适用于微生14种SSCP带型,前者无法区分各血清型之间的差异,物种间、亚种间乃至菌株间的亲缘关系分析,以及未知而后者既能分型还能分亚型,因此该法可作为血清学[12][16]菌株的快速鉴定等。在同一地点重复进行这种群分型和噬菌体分型的补充。Sabine等用该法研究落筛选的方法,就可以确定在一个特定位点或一个特群落的演替和菌种的多样性,并与传统的培养方法比[13]定生态系统中微生物生物多样性的变化情况。与较指出PCR-SSCP方法避免了传统培养的费时费力以RFLP法相比,RAPD法所需的模板量少,操作快,不及误差大的干扰,适合对微生物群落结构和演替的分[17]需要知道DNA序列信息,并且获得基因图谱较迅速,析。随着毛细管电泳技术的出现,Raflaa等首次把标记密度较大。而且DNA样品需要量较少,引物价毛细管电泳SSCP分析用于细菌的鉴定研究,PCR扩格便宜,成本较低。但是RAPD法存在实验重复性较增产物经热变性后进行毛细管电泳及自动DNA序列差,结果可靠性较低的缺点。一般可以通过对单链引分析,数据用基因扫描软件分析处理。这种自动检测物进行筛选,优化PCR条件来克服这一弊端。分析技术便于试验结果的标准化,且大大减少了人为213PCR-SSCP方法误差。随着新技术的发展及计算机软件的运用,相信PCR单链构象多态性研究(PCR-SSCP)方法是将PCR-SSCP技术的方法学将会不断得到改进和完善。PCR反应与单链DNA非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳相214PCR-DGGE方法结合而创立的。即利用DNA单链构象具有多态性,PCR变性梯度凝胶电泳(PCR-DGGE)广泛应用在非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳中电泳时迁移率的不同于微生物生态学的研究中。DNA序列由于含有的碱来分析DNA单链中的基因突变,并称之为/单链构象基不同,各片断的Tm也就不同,甚至一个碱基对的不多态性0(SSCP)。由于该技术敏感性高、操作简便,因同,都会引起Tm很大的差异。DGGE或TGGE就是此广泛应用于癌基因、抑癌基因、遗传病、免疫性疾病、应用这种差异来区分不同的基因序列。这种电泳方法传染性疾病等多种基因突变的检测和基因多态性分在聚丙烯酰胺中加入甲酰胺(DGGE),从正极到负极[14]析,近年来被应用到微生物生态学的研究。单链梯度递加,或是形成温度梯度(TGGE)。电泳中的DNA片段呈复杂的空间折叠构象,这种立体结构主要DNA到达它的变性甲酰胺浓度或温度时,双链部分解是由其内部碱基配对等分子内相互作用力来维持的。开,造成泳动速度发生变化,从而达到分离效果。而且当有一个碱基发生改变时,会或多或少地影响其空间染色后的凝胶用成像系统分析,还可以半定量地测定构象,使构象发生改变。空间构象有差异的单链DNA样品DNA浓度的大小,反映微生物群落组成的变化。分子在聚丙烯酰胺凝胶中受排阻大小不同。因此,通该法扩增环境样品的16SrRNA的部分基因序列过非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳,可以非常敏锐地将构(100~400bp),通过DGGE或TGGE分离,收集不同象上有差异的分子分离开。SSCP技术刚建立时是将条带的DNA测序,再同基因文库中的现有序列比较,同位素掺入PCR扩增物中,通过放射自显影来显示结即可确定微生物的种类。该方法的要点在于PCR引果,这给该技术的推广造成一定的困难。随着DNA物的选择。由于扩增的环境样品成分复杂,所以研究\n现代生物技术在分子微生物生态学中的应用邓小宽等#167#人员都选择了核糖体小亚基DNA的保守序列作为引及研究目的选择使用。物。为了便于电泳的分析,被分析的片断不能大于3PLFA谱图分析400bp;为了提高分辨率,引物的5c端有一个40bp左右磷脂脂肪酸(PLFA)谱图分析、脂肪酸(MFA)谱[18]的发夹结构,但提高了引物合成的成本。Salles等图以及甲基脂肪酸酯(FAME)谱图在微生物生态群落用设计的伯克霍尔德菌属特异性引物进行的PCR-动态分析上的应用也是非常广泛的。磷脂是构成生物DGGE检测和分析两块草地样地中伯克霍尔德菌属群细胞膜的主要组分,约占细胞干重的5%,在细胞死亡落的多样性,揭示主体和根际土壤样品中生物多样性时,细胞膜很快被降解,磷脂脂肪酸被迅速地代谢掉,[19]的不同。Short等用藻类病毒特异性PCR引物扩因此它只在活细胞中存在,十分适合于微生物群落的增DNA多聚酶基因片段的DGGE,研究了不同地理位动态监测。另一个重要因素是脂肪酸具有属的特异置病毒群落的多样性。性,特殊的甲基脂肪酸已经被作为微生物分类的依据。PCR-DGGE可同时分析多个样品,使该技术成为磷脂脂肪酸谱图分析法首先将磷脂脂肪酸部分用监测微生物群落动态的一种强有力的工具。Lapara等Bligh和Dyer法提取出来,然后用气相色谱分析,得出研究了升高温度对好氧生物废水处理过程中细菌群落PLFA谱图。群落的微生物结构发生变化,即可以通结构和功能的影响,DGGE分析细菌群落揭示每一温过谱图的变化得到快速有效的监测。PLFA谱图分析度支持独特的细菌群落。PCR-DGGE用于分析华盛方法已经被广泛地应用于检测环境样品的微生物生物[20]顿州东部4种土壤中细菌群落结构和多样性,结果量、群落结构、营养状况和新陈代谢活动等。Saetre[23]表明,管理和农学实践对细菌群落结构的影响比年降等研究了挪威云杉与桦树混合林中土壤微生物群[21]水量更大。Heuer等连续3年通过DGGE和多种落的空间差异。结果表明,云杉比桦树对PLFA谱图培养方法,与野生型植物、不带有溶菌酶基因的转基因的影响更大,并且成为主成分分析中的第一影响因素。[24]对照比较,分析了2株产生T4溶菌酶保护其免受细菌Ibekwe等探讨了熏蒸对土壤微生物群落的影响,感染的转基因土豆系的根际细菌群落。运用蓝细菌和土壤微生物群落在熏蒸处理后的恢复能力用PLFA和硅藻16SrRNA特异的引物对稻田土壤中提取的总变性梯度凝胶电泳等方法来检测。结果表明熏蒸剂DNA进行PCR扩增后,通过DGGE技术对PCR产物MeBr对土壤微生物群落具有很大的影响。PLFA谱进行分析。结果表明,在水稻生长的不同时期,稻田蓝图分析方法虽然不能在菌种和菌株的水平精确地描述细菌及硅藻种群也在变化,田间不同位置蓝细菌及硅环境中微生物的种类,但是能定量描述环境样品中的藻种类也有所不同,并且每一时期都有其优势的蓝细微生物群体,并且操作相对简便,是一种快捷、可靠的菌及硅藻种群。这一结果为DGGE扩增条带所代表分析方法。[22]的田间蓝细菌种类的测序鉴定奠定了基础。甲基脂肪酸酯是细胞膜磷脂水解产物,该方法是基于PCR的方法有很多,上述几种分子生物学方利用气相色谱分析系统分析全细胞的FAME谱图。[25]法已经建立了比较成熟的技术。它们的共同点是首先Sheridan等通过试验验证了FAME谱图法分析土提取环境样品的核酸,然后用合适的引物扩增。因此壤微生物群落的可行性,还同时进行了生物量、分类结样品的核酸提取纯化迄今仍是研究的重点。基于构的试验,结果表明FAME谱图法能够检测出土壤微[26]PCR技术的方法解决了由于VNBC状态而导致大部生物群落细微变化。Werker等利用FAME谱图分分环境微生物不能被鉴定出来的状况。但是它们同时析法来估计生物方法处理废水时固体颗粒的微生物群还存在有许多不足之处:环境样品在提取核酸前,其样落的生态结构。他们从固体颗粒提取脂肪部分,用毛品微生物不可避免地发生一些变化,试验结果难免与细管气相色谱仪分析脂肪酸包含的酯类,从而获取微实际情况有所偏差;由于每次提取DNA的效率会有生物生物量及其细微群落结构。所不同,对试验结果的重复性影响较大;引物对环境样4rRNA基因同源性分析方法品中不同微生物核酸扩增效率不同而引起丰度估计偏rRNA基因同源性分析方法是综合应用多项分子差;由于真核生物的核糖体的编码基因以及调节机制生物学技术对细菌中rRNA基因进行分析,从而揭示比较复杂,对其的研究还不够透彻,现今应用在真核微微生物多样性,这是分子微生物生态学中最重要的方生物生态学的分析上还是比较少。总之,目前这些方法。在rRNA基因同源性分析方法中,所使用的技术法应用大大推进了微生物生态学的研究,几种方法分主要包括环境样品总DNA的提取、引物及探针的设别有各自的应用特点,可根据不同生态系统的特点以计、PCR扩增、梯度胶电泳(包括DGGE和TGGE)、\n#168#国外医药抗生素分册2006年7月第27卷第4期RFLP、基因文库的筛选、序列测定、序列分析及系统树列已探明,为物种之间亲缘关系的鉴定找到了更为迅构建、斑点杂交和全细胞原位杂交及网式探针杂交等。速有数的手段。现在很多研究人员利用16SrRNA来这些技术可根据研究目的及对象的不同单独使用或选研究土壤微生物的多样性。该技术还可以用来监测因[27]择组合使用。rRNA基因分析方法是微生物多样性及环境改变而引起的微生物种群的变化。Buckley等微生物生态学研究方法上的革命,极大地推动了微生提取土壤中微生物的RNA,通过标记过的不同引物扩物多样性的研究。增,确定16SrRNA的丰度,同时根据PCR扩增的16S411rRNA技术rDNA的荧光标记末端多形态限制性片断来判断微生16SrRNA扩增片段核苷酸序列分析技术是分子物群落的生态状况。rRNA技术提供了一种摆脱传统微生物生态学研究最早应用的方法之一,并在分子微的纯种培养方法鉴定环境微生物的途径,并已被广泛生物系统学、微生物的分类鉴定等研究方面作出了重应用于对诸如共生细菌和古细菌(其中包括医学上对要贡献。rRNA间隔翻译区核苷酸序列分析方法利用病原菌的检测和鉴定)、趋磁细菌、海洋微型浮游生物微生物特异ITS引物,对环境样品尤其是难分离的微以及土壤细菌等微生物类群的研究,并发现了众多未生物共生样品进行鉴定和分类,解决了由于微生物不知的新序列。rRNA技术与其它的分子技术以及特别可培养性而导致难题。一个细菌的16S和23SrRNA是与传统的纯种培养方法相结合,具备分析微生物多分子的平均大小分别是1500和3000核苷酸左右,而样性的巨大潜力。随着这些新的分子方法的不断改进且其基因上的序列单元以不同的速率进化,如果对它以及rRNA数据库中序列信息的不断增加,我们可以们进行全序列或大部分序列(1000个核苷酸以上)的预料rRNA技术的应用也必将更加广泛和普遍化。测定,则它们携有的信息就足以用来进行可靠的系统5其他分析方法发育关系的分析以及微生物群落多样性的研究。511T-RFLP412寡核苷酸探针杂交末端限制性片段长度多态性(T-RFLP)又被称为由于16SrRNA比较测序过程存在潜在的偏差,16SrRNA基因的末端限制性片段(TRF)分析技术,使得有必要在样品的核酸初始提取物或在扩增产物的是一种新兴研究微生物多态性的分子生物学技术。该混合物中的细胞内确证所获得序列的存在并估算其相技术已被成功地应用到了各种微生物群落的比较分对丰度。而这一过程一般通过核酸探针的杂交来实析、研究微生物群落多样性及结构特征等方面。T-现。利用rRNA分子进行微生物生态学研究的一个主RFLP是根据16SrRNA的保守区设计通用引物。其要优势是它们本身能够作为杂交探针的靶分子,而这中一个引物的5c端用荧光物质标记,常用荧光物质有些探针可以被设计用以检测特定的微生物。如果有关HEX、TET、6-FAM等。末端限制性片段技术不但可的rRNA基因的序列是已知的,则可以直接设计并化以进行微生物种类的定性分析,还可以进行定量分析。学合成短的寡核苷酸DNA探针,作为rRNA或其序T-RFLP技术重复性好,平行样得到的峰也是几乎完列的一部分,通过克隆、体内或体外酶促转录等各种方全一样的,因此用它来进行定性和定量分析是可靠[28][29]法进行复制。如此获得探针的好处是事先不必知道靶的。Liu等利用T-RFLP法分析了活性污泥、生分子的序列信息,而这对于发现和研究新的微生物种物反应器内污泥、含沙水层以及白蚁内脏中微生物种非常重要。寡核苷酸探针杂交一般采用定量点渍(dot群的多样性,结果表明,T-RFLP是评估复杂微生物群blot)杂交、全细胞及原位杂交和利用系列探针渐进杂落多样性、比较不同生态环境下微生物群落多样性及交等。通过原位杂交还可以了解目前不可培养微生物结构的快速有效方法。作为一种研究微生物群落特征的细胞形态、丰度,原位分析其空间分布,甚至可以估的理想方法,近几年来,T-RFLP技术的应用发展尤为算单个细胞。微生物各系统发育类群具有各自的迅速,相信会越来越受到研究人员的重视。rRNA序列局部的特征,这些广泛存在的rRNA分子512编码蛋白质的基因上的核苷酸序列的差异不仅可用来确定各微生物类群编码蛋白质的基因除了rRNA基因外,编码蛋白之间在系统发育上的位置,而且可用来鉴定环境中相质的基因在很大程度上决定了一群微生物或一个物种应的微生物。的特征。通常通过端氨基酸来推测一段DNA序列,413rRNA技术的发展前景以此作为鉴定基因库中相关基因的探针,从亚克隆中16SrRNA可以说是当今研究得最透彻的分子之获得的序列可以显示分类专一性靶序列的存在。一,目前已有上百个物种的部分或全部16SrRNA序\n现代生物技术在分子微生物生态学中的应用邓小宽等#169#513质粒指纹图谱分析[3]ConnallyR,VealD,PipeJ1Highresolutiondetectionof质粒指纹图谱分析属于对染色体外的遗传因子进fuorescentlylabeledmicroorganismsinenvironmentalsamplesusingtimeresolvedfluorescencemicroscopy[J]1FEMSMi-行的研究。质粒的大小和数目随物种的不同有所差crobiolEcol,2002,41:239异,但是质粒数是相对稳定的,它可用来区分同一物种[4]Perry-O.keefeH,RigbyS,OliveiraK,etal.Identification的不同菌株。该技术已广泛用于葡萄球菌、耶尔森菌、ofindicatormicroorganismssingastandardizedPNAFISH军团菌及淋球菌等多种细菌的流行病学调查。研究表method[J]1JMicrobiolMethods,2001,47(3):281明,该技术的特异性与噬菌体分型相当或更高,明显优[5]SekiguchiY,KamagataY,OhashiA,etal1Diversityand于血清学、生化分型和药敏试验,可用于多种病原菌感Spatialdistributionoftheanaerophyteinmudparticalexist-染引起疾病的流行病学调查。ingintheUASBreactor.[J]1WaterSciTechnology,2002,另外,低分子质量RNA分布图分析方法利用tR-45(10):19NA(75~90个核苷酸)和5SrRNA(105~120个核苷[6]LeeTJ,KawaharasakiM,MatsumuraM,etal.Microbial酸)的双相电泳分离。这些分子的长度差异的专一性communitystructuresofactivatedsludgesdominatedwith特征已被用于生丝微菌属和假单胞菌属等物种的鉴polyphosphateaccumulatingbacteriaandglycogenaccumulat-ingbacteria[J].EnvironTechnol[J]12002,23(7):747定,浮游真菌和支原体中的5SrRNA明显比正常5S[7]PeraudO,YousafM,HamannMT,etal.Microbialcom-rRNA小,这利于将这些菌从自然样品中区分开来。munityanalysisofamarinespongethatcontainstheant-i高分辨率凝胶能将近60种tRNA按大小分离出来,因malarialcompoundmanzamine[C].AbstractsoftheGeneral此是一种非常有前途的鉴定方法。MeetingoftheAmericanSocietyJorMicrobiology,2002,6展望102:337现代分子生物学技术在微生物多样性研究上的应[8]BriningMM,LeppPW,PrevalenceofbacteriaofdivisionTM用克服了微生物培养技术的限制,能对样品进行较客7inhumansubgingivalplaqueandtheirassociationwithdis-观的分析,较精确地揭示了微生物种类和遗传的多样ease[J].ApplEnvironmMicrobiol,2003,69:1687性。AFLR、SSCP、RAPD、DGGE、TGGE等基于PCR[9]WintzingerodeVF,LandtO,EhrlichA.Peptidenucleicacid-mediatedPCKclampingasausefulsupplementinthedeter-技术的现代生物学方法已被广泛应用到了微生物生态minationofmicrobialdiversity[J].ApplEnvironMicrobiol,学的研究当中。但在解决实际问题的过程中,各种方2000,66:549法组合应用,往往可以避免由于方法原理本身所带来[10]VolpiniAC,PassosVMA,OliveiraGC,etal.PCR-RFLP的不可避免的偏差,提供了更加全面的群落组成、变化toidentifyLeishmania(Viannia)braziliensisandL(Lelsh-方面的信息,相信必将成为今后研究的有力工具。mania)arrtazonensiscausingAmericancutaneousleishmania-总之,分子生物学技术和研究策略将成为揭示自sis[J].ActaTmpica,2004,90:31然界各种环境中微生物多样性的真实水平及其物种组[11]TanpiboonsakS,PaemaneeA,BunyarataphanS,etal.PCR成,进行分子微生物生态学研究的基础和核心。但是-RFLPbaseddifferentiationofBurkholderiamalleiand在研究和发展分子微生物生态学的过程中,应该注意BurkhoIderiapseudomallei[J]1MoleculCellulProbe,2004,分子生物学技术本身存在的不足及其在研究过程中不18:97稳定因素对实验结果的影响[30]。因此,在利用分子生[12]RamasotaP,ChansiripornchaiN,KalleniusG,etal.Compar-isonofMycobacterlumaviumcomplex(MAC)strainsfrom物学所取得的结果进行理论探讨时,应该时刻考虑到pigsandhumansinSwedenbyrandomamplifiedpolymor-方法的代表性和稳定性。只有这样才能使分子微生物phicDNA(RAPD)usingstandardizedreagents[J].VeteMi-生态学健康发展,才能真正推动微生物生态及其理论crobiol,2001,78:251研究的快速发展。[13]ChansiripornchaiN,RamasotaP.DifferentiationofavianpathogenicEscherlchiacoli(APEC)strainsbyrandomampl-i参考文献fiedpulymorphicDNA(RAPD)analysis[J].VeteMicrobiol,[1]HeadIM,SaundersJR,PickupRW1Microbialevolution,2001,80:75diversityandecology:adecadeofribosomalRNAanalysisof[14]StachJEM,BatheS,ClappJP,etal.PCR-SSCPcompar-iuncultivatedmicroorganisms[J]1MicrobEcol,1998,35:1sonof16SrDNAsequencediversityinsoilDNAobtainedus-[2]RaapAK1Advancesinfluorescenceinsituhybridization[J]1ingdiferentisolationandpurificationmethods[J].FEMSMuratRes,1998,400:1287MicrobiolEcol,2001,36:l39\n#170#国外医药抗生素分册2006年7月第27卷第4期[15]NairS,LinTK,PangT,etal.CharacterizationofSalmonel-[23]SaetreP,BfifithE.Spatialvariationandpatternsofsoilm-ilaserovarsbyPCR-single-strandconformationpolymorphismcrobialcommunitystructureinamixedspruce-birchstandanalysis[J].JClinMicrobiol,2002,40(7):2346[J].SoilBiolBiochem,2000,32:909[16]SabineP,StefanieK,FrankS,etal1Successionofmicrobial[24]IbekweAM,PapiernikSK,GanJY,etal.Impactoffum-icommunitiesduringhotcompostingasdetectedbyPCR-gantsonsoilmicrobialcommunities[J].ApplEnvironMi-single-strand-conformationpolymorphism-basedgeneticcrobiol,2001,67(7):3245profilesofsmall-subunitrRNAgenes[J]1ApplEnviron[25]HackSK,GarchowH,OdelsonDA,etal.Accuracy,repro-Microbiol,2000,66(3):930ducibility,andinterpretationoffattyacidmethylesterpro-[17]RaflaaG,PhilippeM,AgnesF,etal.Capillaryelectrophore-filesofmodelbacterialcommunities[J].ApplEnvironMi-sissingle-strandconformationpolymorphismanalysisforcrobiol,1994:2483rapididentificationofPseudomonasaeruginosaandother[26]WerkerAG,HallER.Quantifyingpopulationdynamicsbasedgramnegativenonfermentingbacillirecoveredfrompatientsoncommunitystructurefingerprintsextractedfrombiosolidswithcysticfibrosis[J]1JClinMicrobiol,1999,37(10):3374samples[J].MicrobEcol,2001,41:195[18]SallesJF,DeSouzaFA,VanElsasJD1Molecularmethodto[27]BuckleyDH,SchmidtTM1Thestructureofmicrobialcom-assessthediversityofBurkolderiaspeciesinenvironmentalmunitiesinsoilandthelastingimpactofcultivation[J]1Mi-samples[J]1ApplEnvironMicrobiol,2002,68(4):1595crobEcol,2001,42:11[19]ShortSM,SuttleCA1Sequenceanalysisofmarineviruscom-[28]LuedersT,FriedrichMW.EvaluationofPCRamplificationmunitiesrevealsthatgroupsofrelatedalgalvirusesarewidelybiasbyterminalrestrictionfragmentlengthpolymorphismdistributedinnature[J]1ApplEnvironMicrobiol,2002,68analysisofsmallsubunitrRNAandmcrAgenesbyusingde-(3):1290finedtemplatemixturesofmethanogenicpureculturesand[20]IbekweAM,KennedyAC,FrohnePS,etal1Microbiald-isoilDNAextracts[J].ApplEnvironMicrobiol,2003,69:versityalongatransectofagronomiczones[J]1FEMSMi-320crobiolEcol,2002,39(3):1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