分子生态学在生物膜微生物研究中的应用前景

化学工程师ChemicalEngineer2013年第O2期文章编号：10o2—1124(2013}02一o046—04：环。：分子生态学在生物膜微生物蘧研究中的应用前景李妙婉，于衍真，冯岩(济南大学土木建筑学院。山东济南250022)摘要：利用分子生态学技术分析研究生物膜内细菌种群，对有效处理污水，提高氮磷去除率有着极为重要的意义。本文介绍了提取总DNA、PCR、DGGE、RFLP、SSCP和FISH等常见分子生态学技术，综述了国内外的研究进展，探讨了分子生态学技术在生物膜内微生物群落研究的应用前景，为探寻生物膜内微生物的多样性、结构与分布以及动态性拓宽了思路。关键词：PCR；DGGE；RFLP；SSCP；FISH；微生物群落；生物膜中图分类号：TS201．3；Q93文献标识码：AProspectsofmolecularecologyinbiofilmmicrobiologyresearch‘LIMiao—wan，YUYan—zhen，FENGYan(SchoolofCivilEngineeringandArchitecture，UniversityofJinan，Jinan250022，China)Abstract：Usemolecularecologytechnologytoanalyzebacteriapopulationsinbiofilm，whichhasaveryim-portantsignificanceforeffectivesewagetreatmentandimprovementofnitrogenandphosphorusremovalrate．ThisarticledescribedtheextractionoftotalDNA，PCR，DGGE，RFLP，SSCP，FISHandothercommonmoleculareco]o—gytechniques，summarizedresearchesatdomesticandforeign，discussedtheapplicationprospectsofmoleculare—cologytechniquesforstudyofmicrobialcommunitiesinbiofilm，broadenedtheideaofexploringthediversityofmicroorganisms，thestructureanddistribution，aswellasthedynamic．Keywords：PCR；DGGE；RFLP；SSCP；FISH；microbialcommunities；biofilm曝气生物滤池(BiologicalAeratedFilter，简称“BAF”)出现在80年代的欧洲，在90年代已经发展1与微生物群落结构分析相关的分成熟，但在我国的研究应用整整晚了近l0—15年的子生态学研究方法时间。近年来，国内学者对BAr的研究多见于反应1．1样品总DNA提取器处理效能和工艺特性的探讨，而有关微生物种群作为分子生态学技术的第一步，提取样品总组成等机理研究却一直进展缓慢⋯。微生物群落的DNA十分关键。由于土壤、活性污泥和生物膜等样多样性、结构与分布和动态性对维护和运行BAF有品中细菌种类繁多并且含有相当多的杂质，怎样高着十分核心的作用。及时观测微生物群落的动态变效地裂解细胞、充分释放DNA、有效去除杂质已成化，是对BAF进行有效调控的关键。然而，传统的微为研究热点。而试剂盒法是目前广泛使用的方法之生物研究方法并不能满足跟踪研究的要求，分子生一态学技术的迅速发展让揭示污染物负荷和微生物，它包含了一整套的细胞裂解和DNA纯化的程序，是一种针对土壤样品的方法，但通常情况下也适群落以及BAF处理效果之间的相互关系成为可能，用于活性污泥及生物膜。目前，比较常用的试剂盒现已成为污水处理中一个具有广泛应用前景的研有QIAampRDNAminikit，FastDNASpinKitfor究方向。Soil，柱式基因组DNA抽提试剂盒等。1．2聚合酶链式反应收稿臼期：2012一l1—3OPCR技术是二十世纪80年代中期由Kery基金项目：中国国家科学基金会(NsFc51178207)；山东省国家科学基金会(ZR2011EEM003)财政支持Mullis发展起来的一种在短时间内即可扩增获得大作者简介：李妙婉(1989一)，女，山东济南，在读硕士研究生，市政工程量目的基因技术，具有产率高、特异灵敏、操作简专业。便、易自动化等优点。对含少量生物量的样品，PCR通讯作者：于衍真，女，教授，硕士生导师。\n2013年第2期李妙婉等：分子生态学在生物膜微生物研究中的应用前景47技术是十分有效的，解决了在分子生态学中受到的2．1微生物群落的多样性研究DNA量限制的问题，不仅为分子生态学的发展做出近些年，有很多研究者。】又寸活性污泥、生物膜了巨大的贡献，同时也为分子微生物生态学分析技中的硝化细菌的多样性进行了分析总结，他们分别术的建立提供了有利工具。在废水生物处理方面，通过FISH、DGGE、16SrRNA克隆文库技术等现代往往采用经过修正的或与其它技术联合应用的分子生态学技术手段研究发现，进行氨氧化作用的PCR衍生技术，像逆转录PCR(RT—PCR)、定量PCR主要有亚硝化杆菌(Nitrosomonassp．)和亚硝化螺菌(Q—PCR)和巢式PCR(nested—PCR)等。(Nitrosospirasp．)；进行亚硝酸氧化的主要是硝化球1．3变性梯度凝胶电泳技术菌(Nitrococcussp．oDGGE最初是由Muyzer等在1993年应用到孙宝盛等人⋯】在实际工程中比较了不同条件微生物群落结构研究。与传统方法相比，DGGE能够下的同一系统内的微生物群落多样性，从这些研究迅速准确地鉴定自然或人工环境中的微生物种群，中可以看出，微生物群落结构主要是由环境条件决被广泛用来研究复杂微生物群落的多样性、结构与定。在长期稳定运行后形成了各自特定的群落结构，分布、动态性以及细菌分离物的富集培养效果。目既有共同的优势种群也有各自特有的种群，相同的前，该技术已被广泛用于土壤、活性污泥、生物膜、微生物种群在不同反应器中的优势地位不同，各自湖泊等各个领域。特有的种群则是由于水质的不同经过长期演替而1．4限制性片段长度多态性技术来。RFLP技术是一种全面、准确、重现性好、分辨2．2微生物种群结构与分布研究率高、易自动化的分子指纹图谱技术，可对微生物许春红等【l2】研究了处理抗生素废水的厌氧复合群落结构进行快速分析，描述微生物的多样性，检床中的微生物种群的多样性。结果显示，反应器中微测微生物随时间、空间及环境扰动的变化而产生的生物种群十分丰富，距底部3m以下的种群最多且变化，是当下分析微生物种群结构较多采用的技术相似性较高，3m以上的填料位置种群明显减少，除之一。均以产甲烷菌为主外，污泥床层与填料层中分别有1．5单链构象多态性分析各自不同的优势菌种与产甲烷菌进行协同作用。SSCP分析是随着研究人类基因组而发展起来Ren等fJ3采用DGGE研究处理已稀释畜牧废的，最初是用来检测人类的基因多态性，Lee等[。]1996水的A／O反应器在启动阶段时微生物的群落结构，年首次报道将SSCP应用到环境样品微生物群体多发现微生物群落变化与反应器的处理效果具有一样性分析，此后被广泛应用于微生物区系、微生物致性。在厌氧区，主要的优势菌种有Firmicutes、多样性等研究领域。Proteobaeteria、Chloroflexi和Bacteroidetes；在好氧区，1．6荧光原位杂交技术其优势菌种有Proteobacteria、Bacteroidetes、Firmi—FISH技术是一种将分子生物学的精确性和显cutes、Verrucomicrobiae和Nitrospira。微镜的可视性相结合而发展起来的。1989年DelongJang、孙寓娇和Tsuneda等人采用FISH和第一次采用荧光标记寡核苷酸探针来检测单个微原位PCR分别对SBR反应器、UASB反应器的好氧生物细胞。与放射性探针相比，荧光探针更加安全，颗粒污泥和硝化反应器的生物膜内的氨氧化菌(AOB)和硝化细菌的分布进行检测，结果表明：AOB分辨率更高，不需要额外的检测步骤，可同时检测多个靶序列。FISH技术是一种细胞水平上的原位菌主要位于颗粒的表层和核心区域，硝化细菌则主要落杂交技术，不仅可以测定样品中不可培养的微生分布在颗粒内层。物的形态特征及丰度，还可以原位分析整个微生物2．3微生物种群动态性分析研究群落的组成、结构、空间分布及数量分布以及动态有众多学者专家【l7_研究了不同的污水处理系地跟踪微生物种群的变化。目前，FISH技术已广泛统内运行不同时期的总的菌群类型的动态变化。结应用于环境微生物学研究和微生物生态学研究中。果表明，随着系统运行时间的增长，菌群的活性明显提高，细菌类群明显简化，优势菌群具有时序动2分子生态学技术在微生物群落结态性，与污水处理效果有着协同变化的特征。研究构分析中的应用还发现，温度、pH值和DO等因素对微生物群落结构有显著影响。\n李妙婉等：分子生态学在生物膜微生物研究中的应用前景2013年第2期Zhang等研究了OLAND系统中氧控制的亚参考文献硝化步骤中AOB菌的群落结构变化。结果表明，在【1]马军，邱立平．BAF及其研究进展【J]．环境工程，2002，2o(3)：7—11．氧控制的亚硝化步骤的主要AOB菌是Nitro—[2]MuyzerG，DewaalEC．Profilingofcomplexmicrobialpopulationssomonas，当溶解氧逐渐降低时，AOB菌的群落发生byDGGEanalysisofpolymerasechainreactionamplifiedgenes剧烈变化。codingfor16SrRNA[J]．AppliedandEnvironmentalMicmbiolo-gY，1993，59(3)：695-700．3分子生态学技术在生物膜内微生13JLeeDH，ZoYG，KimSJ．NonradioactiveMethodstoStudyGenet—icProfilesofNaturalBacterialCommunitiesbyPCR—single-strand物群落研究中的应用前景ConformationPolymorphismlJJ．App1．Environ．Microbial，1996，62：3l12—3120．对于生物处理系统来说，微生物的活性以及有[4]邢德峰，任南琪，李建政．FISH在环境微生物学中的应用及进展效微生物在系统内的浓度是最为关键的操作参数。[J]．环境科学研究，2003，16(3)：55—58．然而自然环境中可用于培养的微生物种类少之又15JLeeN，Jansen儿，AspegrenH，eto1．Populationdynamicsin少，还有相当多的菌种因无法培养而不能被人类所wastewatertreatmentplantswithenhancedbiologicalphosphorus研究利用。分子生态学技术克服了这一弊端，为水removaloperatedwithandwithoutnitrogenremoval[J]．WaterSci-处理事业开拓了新的方向和思路。enceandTechnology,2002,46(1-2)：163-170．，2003，16(3)55—58．16JPYNAERTK，SMETSBF，BEHEYDTD，eto1．Startupau—(1)可以利用16SrDNA序列分析法与其他分totrophicni~ogenremovalreactorviasequentialbiocatalystaddi-子生态学技术相结合，鉴定生物膜中的菌群种类。tion[J]．EnvironSciTechnol，2004，38：1228—1235．虽然16SrDNA序列分析法不能对生物膜中各类微I7JTSUNEDAS，TATSUON，HOSHINOT，eto1．Characterizationof生物的丰度精确计算，但可根据特定微生物的克隆nitrifyinggranulesproducedinanaerobicupflowfluidizedbedre-数与总的克隆数之比估算出相对丰度。actorlJJ．War．Res．，2003，37：4965—4973．[8]钦颖英，李道棠，杨虹．给水生物预处理反应器的细菌种群多样(2)利用DGGE技术可在同样的污水、同样的性及其群落结构[J]．应用与环境生物学报，2007，13(1)：BAF工艺、不同的滤料情况下，进行微生物群落结104—107．构的比较；反应器在不同运行时间和条件(如滤柱19jCoskunerG，TCurtis．Insitucharacterizationofnitrifiersinanac—高度、温度、pH值、有机负荷、氨氮负荷、水力停留tivatedsludgeplant：detectionofNitrobacterSp[J]．JournalofAp-时间等)下，微生物群落结构的变化等。在DGGE凝pliedMicrobiology，2002，93(3)：431-437．【10jJuretschkoS，eta1．，Combinedmolecularandconventionalanaly—胶上，切下较为清晰明亮的条带，通过序列分析可sesofnitrifyingbacteriumdiversityinactivatedsludge：Nitroso-鉴定该条带所代表的微生物的分类。或者可根据条coccusmobilisandNitrospiralikebacteriaasdominantpopulations带的序列设计探针，通过FISH技术对该类微生物【J]．AppliedandEnvironmentalMicrobiology，1998，64(8)：计数。3042-3051．(3)RFLP技术可用来鉴别生物膜上微生物的[11]孙宝盛，张斌，吴卿，等．应用PCR—DGGE技术解析膜生物反应器中微生群落多样性[J]．天津大学学报，2008，41(3)：356—361．种类，还能定量检测优势基因片段的相当数量，从[12]许春红，买文宁，赵继红．PCR—DGGE研究UBF中微生物种而可以确定种群中的优势微生物，同时还可以检查群多样性[J]．河南科学，2006，24(5)：754—756．种群内是否有基因变异。1l3]RENLJ，WuYN，RENNQ，eta1．Microbialcommunitystruc-(4)利用FISH技术可以同时对生物膜内不同tureinanintegratedA／Oreactortreatingdilutedlivestockwastew-类群的细菌在细胞水平上进行原位的定性定量分aterduringstartupperiod[J]．JournalofEnvironmentalSciences，2010，22(5)：656—662．析和空间分布标示。1l4]JANGA，YOONYoung2Han．Characterizationandevaluationof(5)以PCR为原型的定量PCR，可用于分析生aerobicgranulesinsequencingbatchreactor[J]．JoumalofBiotech-物膜样品中特定的微生物种类和种群定量，也可以nology，2003，105：71-82．研究特异微生物的组成及其变化规律。[15]孙寓娇，左剑恶，杨洋，等．好氧亚硝化颗粒污泥中硝化细菌的(6)将生物膜样品中混合种群的核酸进行PCR群落结构分析[J]．环境科学，2006，27(9)：1858—1861．扩增，克隆全部基因片段并测序，建立序列文库，通116jTSUNEDAS，TATSUON，HOSHINOT，etnf．Characterizationofnitrifyinggranulesproducedinanaerobicupflowfluidizedbed过对大量克隆子序列的信息采集，可以测定总基因reactor【Jj．Wat．Res．，2003，37：4965—4973．的多样性和特定种群的组成。[17]许玫英，曾国驱，任随周，等．分子检测技术对活性污泥中AOB的比较研究[J]微生物学报，2003，43(3)：371—378．(下转第51页)\n2013年第2期邓卫东：海洋平台防腐中热喷铝防腐技术的应用孔，那么海洋环境中的酸性离子，如so2和cl就会4热喷铝防腐技术在海洋环境中的穿透这些孔隙而致使海洋平台金属基体发生腐蚀防腐性能现象。因此，应该将表面喷铝的工件放人加热炉中进行热扩散以便提高其耐腐蚀性，温度控制在喷涂层在海洋环境中有较突出的防腐性能。430～450℃左右。1993年挪威科学家公布的其11个月的曝露试验结3．5封闭果表明，喷铝层的腐蚀速度为2～3m·a-，因此，工件表面在经过热扩散和热喷涂之后，往往不200m厚的涂层防腐寿命可达6O年以上。1995年会有较好的光洁度。所以在工件进行了热扩散后，应德国科学家研究结果表明，热喷铝层已成为海岸及该封闭处理试件表面，目的就在于要在最大程度上海洋环境中钢结构的重要防护方法。采用电弧热喷封住涂层孔隙，同时将凹坑(由喷涂颗粒堆砌而成)涂得到的200m厚的热喷铝层在海洋飞溅区的防尽可能地填平。另外，在有条件的情况下，还可以对腐寿命可超过3O年。我国腐蚀数据网站也进行了已封闭的金属涂层进行涂装，以便美观大方、且有热喷涂层在海洋环境中耐蚀性的研究，其研究结果效延长防腐措施的使用寿命。同时，还应该从涂层表明喷锌、铝及铝镁涂层均可作为长寿命保护涂层孔隙率、涂层厚度、弯曲试验、附着力、外观等方面应用于钢材上，其中喷铝层保护效果尤佳。对涂层进行有效的检测。喷铝涂层加防腐涂料封闭，可大大延长涂层的工艺流程为：工件_表面预处理(喷砂处理Sa2．5使用寿命。从理论和实际应用效果来看，喷铝涂层是～Sa3．0)一喷涂金属涂层有机封闭涂料涂层一常防腐涂料的最好底层。金属喷涂层与防腐涂料的复规面层涂料涂层(根据实际颜色需要)。合涂层的防护寿命较金属喷涂层和防腐涂料防护3．6经济性比较层两者寿命之和还要长，是单一涂料防护层寿命的与传统的环氧富锌底漆、环氧云铁中间漆、丙数倍。烯酸聚氨酯面漆等传统平台防腐油漆的涂层相比，综上所述，热喷铝防腐技术在海洋环境中有着从长期经济性考虑，喷铝涂层比常规的油漆更经济。很好的耐蚀性，有效地构成海洋平台的长效防腐技表1不同涂层的经济性比较术，将会在不久的明天逐渐取代常规油漆的防腐材Tab．1Economiccomparisonofdiferentcoating料。参考文献l1JFroesFH，EliezerD．Thesciencetechnologyandapplicationofmaguesium[J]．MineMetalsandMaterSoc．，2008，31(9)：30—34．[2jGroshartEart．Preparationofnonferrousmetalsforpainting[J]．MetalFinishing，2000，98(A)：82—86．13JUmeharaH．StructureandCorrosionBehaviorofConversionCoatingonMagnesiumAlloys[M]．MaterialsScienceForum．Switzerland：Trans．Tech．Publications．2000．273—282．应器中微生物群落动态[J]．环境科学学报，2007，27(3)：386—390．(上接第48页)[20]MouraA，TacoM，et．Characterizationofbacterialdiversityin[18]胡宝兰，郑平，胡安辉，等．Anammox反应器的启动及其菌群演twoaeratedlagoonsofawastewatertreatmentplantusing变的研究[J]．农业工程学报，2005，21(7)：107一llO．PCR—DGGEanalysis[J]．Microbio1．Res．，2007，(6)：5．[19]苏俊峰，马放，王弘宇，等．PCR—DGGE法分析生物陶粒硝化反