不同龋敏感儿童牙菌斑内微生物群落的分子生态学特点-论文

中国组织工程研究18眷25筋2014—06—18出版ChineseJournalofTissueEngineeringResearchJune18,2014Vo1．18,No．25WWW．CRTER．org不同龋敏感儿童牙菌斑内微生物群落的分子生态学特点刘莉霞’，陈琳(’深圳市第二人民医院口腔科，广东省深圳市518035；佳木斯市金爵齿科研究所，黑龙江省佳木斯市154002)文章亮点：1玻璃离子水门汀释放的氟离子仅能被动增加牙齿的抗龋能力，难以对致龋微生物产生直接抑制作用，导致刘莉霞，女，1974年生，经玻璃离子水门汀充填后的牙体仍易发生继发龋现象。江苏省苏州市人，汉族，1997年湖北医科大学毕2传统上采用的微生物检测分析方法一般依据细菌形态、生理生化特性及免疫血清分型，不但准确性差、费业，主治医师，主要从事时费力，而且由于牙菌斑内能够被培养、分离和纯化的细菌不到50％，若以此来代表牙菌斑内的复杂微生物口腔内科研究群落将导致极大的误差。3实验创新性应用现代分子生态学技术考察不同龋敏感儿童牙菌斑内微生物群落结构与重要致龋微生物种属通讯作者：陈琳，主治医的相对数量变化趋势，较好反映了牙菌斑内与致龋过程密切相关的复杂微生物群落。师，佳木斯市金爵齿科研究所，黑龙江省佳木斯市关键词：154002生物材料}口腔生物材料：童龋病：dmfs指数：变性梯受凝皎电泳：荧光啄位杂交：实时定量PcR：群落多样性：致龋微生物doi：l03969／j．issn2095-4344主题词：2014．25．019口腔：牙菌斑：生态学【htp：／／www．crtar．org】摘要累：。伯背景：玻璃离子水门汀充填的儿童牙体仍易发生继发龋现象，与充填材料表面牙菌斑内复杂微生物群落具有文章编号：2095．4344密切关系，而传统微生物学方法无法获知牙菌斑微生物的重要信息。(2014)25．04043．08目的：利用先进的现代分子生态学技术解析不同龋敏感儿童玻璃离子水门汀表面牙菌斑内微生物群落结构与稿件接受：2014-05_13重要致龋微生物的数量水平。方法：选择3—5岁儿童24名，按乳牙龋失补牙面指数不同分为无组、中龋组和高龋组，每组8名。采集各组儿童全口牙面菌斑，利用变性梯度凝胶电泳进行微生物群落多样性分析与微生物种群鉴定，利用荧光原位杂交考察致龋微生物Streptococcusspp．的数量分布，利用实时定量PCR考察重要致龋菌Streptococcusmutans占总菌的相对数量。’结果与结论：无龋组牙菌斑内微生物群落的多样性显著高于中龋组和高龋组(尸<0．o5)，中龋组和高龋组中大量富集的某些微生物可能在龋病发展过程中起重要作用。3组样本共检出16个微生物菌属，Streptococcusspp．和Actinomycesspp．可能是高龋组中重要的致龋微生物。Streptococcusspp．和Streptococcusmutans在高龋组中所占比例显著高于无龋组和中龋组(P<0．01o综合来看，研究采用的分子生态学技术可以较好反映牙菌斑内与致龋过程密切相关的复杂微生物群落。支麴霞．陈琳商龋敏感L童牙菌斑内微生物群落的分子生态学特点，中国组织I程磺究．2014．18【2514043—4050．、Molecularecologyofmicrobialcommunitiesindentalplaquesofdiferentcaries-susceptiblechildrenLiuLi．xia’ChenLin(’DepartmentofStomatology,SecondPeople’SHospitalofShenzhen，Shenzhen，518035，GuangdongProvince，China；JinjueDentalInstituteofJiamusi，Jiamusi154002，HeilongjiangProvince，China)AbstractBACKGROUND：Childrenteethfilledwithglassionomercementarestillsusceptiblewithseconda~caries．whichisincloserelationshipwithcomplexmicrobialcommunityindentaIplaqueontheSMrfaceofglassionomerLiuLi-xia，AtendingphysicianDepartmentofStomatology．cement．TraditionalmicrobialmethodsareincapableofgettingimportantinformationtowardsdentalplaqueSecondPeople’sHospitalofmicrobes．Shenzhen．Shenzhen518035OBJECTIVE：TOanalyzemicrobialcommunitystructureandnumericaIJeveIofcaries-inducedmicrobesindentaGuangdongProvince，Chinaplaqueonthesurfaceofglassionomercementfordifferentcaries．susceptiblechildren．METH0DS：Twenty-fourchildren(age：3-5years)weredividedintothecaries—free，caries—positive，andCorrespondingauthor：Chencaries—activechildrengroupsbythedecayed，missingandfilledindex．Witheightindividualsineachgroup，theirLin，Atendingphysician，Jinjuedentalplaquesweresampledformicrobialcommunityanalysis．DenaturinggradientgelelectrophoresiswasDentallnstituteofJiamusiemployedtomakeclearthemicrobialcommunitydiversityandspeciesidentityindentalplaqueofthecaries-freeJiamusi154002．Heilongjiangcaries-positive。andcaries—activechildrengroups．Fluorescent／nsituhybridizationwasusedtoinvestigatetheProvince．Chinanumericallevelofthecaries-inducedmicrobeStreptococcusspp．QuantitativePCRwascarriedouttoanalyzerelativequantityofStreptococcusmutansinIotaIbacteria．1SSN2095-4344CN21-1581／RCoDEN：zLKHAH4043\n铷莉霞，等不同龋敏感见煮牙菌斑内微生物群落的分子生态学特点～c一。憎RESULTSANDCONCLUSlON：ComparedwithIhecaries—positiveandcaries—activechildrengroups．microbialcommunitydiversityamongsampleswassignificantlyhigherinthecaries-freegroup．Microbesaboundinthecaries．positiveandcaries—activegroupsmightactimportantrolesinlhedevelopmentofcaries．Streptococcusspp．andActinomycesspp．mightbeimportantcaries—inducedmicrobesinthecaries—activegroup．TheratiosofStreptococcussppandStreptococcusmutansintotaIbacteriaweresignificantlyhigherinlhecaries-freegrouplhanthoseinlhecaries．freeandcaries—positivegroups．1nsummary．molecularecologytechnologiescanwellreflectcaries—relatedcomplexmicrobiaIcommunityindentalplaque．Subjectheadings：mouth；dentalplaque；ecologyLiuLX，ChenL．Molecularecologyofmicrobialcommunitiesindentalplaquesofdiferentcaries-susceptiblechildrenZhongguoZuzhiGongchengYanjiu．2014；18(25)：4043—4050．0引言Introduction1对象和方法Subjectsandmethods20世纪70年代以来，玻璃离子水门汀(glassionomer设计：体外检测实验。cement，GIC)的发明使El腔充填修复材料进入了一个高速时间及地点：于2013年2至11月在深圳市第二人民医发展时期。与磷酸锌水门汀、聚羧酸锌水门汀等传统口腔院口腔内科实验室完成。充填材料相比，GIC具有良好的生物相容性和较小的牙体对象：在深圳民办幼儿园选择3—5岁儿童24名，其中刺激性。此外，GIC中具有较高的含氟量，可与牙齿中羟男13名，女11名，口腔内均有GIC充填材料。根据WHO口基磷灰石发生置换反应生成氟磷灰石，从而使其能够在黏腔健康调查基本方法第4版龋病诊断标准【1”，按乳牙龋失补结充填后长期释放氟离子，提高牙齿的抗酸性并抑制继发牙面指数(decayed，missingandfilled，dmfs)不同分为无龋的产生与发”。但另一方面，GIC释放的氟离子仅能被龋组(dmfs=0，n=8)、中龋组(dmfs=4-6，门=8)和高龋组动增加牙齿的抗龋能力，难以对致龋微生物产生直接抑制(dmfs>6，J=7=8)，所选儿童基本情况见裹1所示。作用，导致经GlC充填后的牙体仍易发生继发龋现象IZJ。从所有入选儿童除龋外均无其他口腔疾病，全身健康，根本上看，这是由于口腔微生物对充填材料具有一定的黏无全身系统性疾病及长期服药史(包括使用氟剂等)，取样附作用，一段时间后在GIC材料表面形成了牙菌斑生物膜前2周内未全身使用抗生素，2h内未进食。在样品采集过所造成。解析口腔充填材料(~IGIC)表面牙菌斑生物膜内的程中，采用灭菌的滤纸纸尖采集GIC表面全口牙面菌斑，微生物，对理解龋病的发生发展过程具有重要意义。利用1mLPBS反复冲洗滤纸纸尖后分别在15000min下以分布最广泛、发病率最高、危害最严重的儿童龋病离心5min(离心半径10cm)，收集沉淀。利用1mLPBS清为例，牙菌斑内微生物菌群组成及存在水平与儿童龋病的洗沉淀，在15000r／min下离心5rain(离心半径10cm)，弃发展过程有密切关系【3】。牙菌斑生物膜的微生物复杂性上清后将得到的牙菌斑样本分成2份，置于一80℃冻存。导致基于纯培养技术仅能鉴定其中极少数的可培养微生实验方法：物。近年来，现代分子生态学在揭示复杂微生物群落的行GIC表面牙菌斑微生物基因组DNA的提取：将每名)为机制方面显示出巨大的技术优势，应用较多的技术包括童的1份牙菌斑样本自然融化后，采用小量细菌基因组DNA变性梯度凝胶电泳、荧光原位杂交、实时定量PCR等【日。快速抽提纯化试剂盒提取牙菌斑微生物的基因组DNA，具体在本实验中，以上几种分子生态学技术被用于揭示儿童操作方法依据试剂盒的使用说明书。采用0．8％琼脂糖凝胶GIC表面牙菌斑内微生物群落结构和致龋微生物的数量电泳检测牙菌斑内微生物基因组DNA的提取效果。变化趋势，对探明儿童龋病的微生物致病因素具有重要意16srDM基片殷C尺扩辔采用大多数细菌16s义。rDNAV6一V8区的通用引物进行PCR扩增。引物BSF968GC表1入选儿童基本情况Table1BaselinedaIaofthechosenchildren4044P．o．Box10002,Shenyang110180WWW．CRTER．org\n女裁霞．等不同龋敏感儿童牙菌斑内微生物群落的分子生态学特点一⋯凹不同龋敏感儿童牙菌斑内微生物群落分子生态学实验的主要试剂与仪器用5mg／L蛋白酶K和1．5g／L溶菌酶将牙菌斑样品处理30min，以增加细胞的通透性。将牙菌斑样品移至载玻片上试剂及仪器来源自然干燥，利用一20℃预冷的梯度乙醇(体积分数50％，PBS、小量细菌基因组DNA快速抽提纯化上海生工生物工程有限公司试剂盒、小量胶回收试剂盒80％，95％，100％)依次脱水。将2种探针各100ng)JH~20pLPCR梯度扩增仪德国Biometra公司杂交液中(含0．9mol／LNaCI、20mmoI，LTris．HCI、体积分数25％甲酰胺、体积分数0．1％SDS，pH7．2)，滴于载玻片上Dcode基因突变检测系统美国Biorad公司牙菌斑样品处。将载玻片放置于湿盒内，在杂交炉内46℃杂交炉美国Thermo公司杂交2h。利用洗脱液(含20mm0I／LTris-HCI、5mmol／L荧光显微镜El本Olympus公司EDTA、159mmol／LNaCl、体积分数0．1％SDS，pH7．5)荧光定量PCR仪美国AppliedBiosystems公司洗脱掉多余探针，在荧光显微镜下进行观测。SYBR。PremixExTaqII试剂盒大连宝生物工程有限公司GIC表面牙菌斑微生物~Streptococcusmutans与总f5’一CGCCCGCCGCGCGCGGCGGGCGGGGCG廖言：鸯PC尺分利用基于SYBRGreen的定量PCR进GGGGCACGGGGGGAACGCGAAGAACCTTAC-3’1行牙菌斑微生物中致龋微生物Streptococcusmu妇ns与总和BSR1401(5’一CGGTGTGTACAAGACCC一3’)¨，分菌的相对定量分析。针对变形链球菌的引物为SMF别对应16srDNA968—984位和1385—1401位的核苷酸序(5’．GCC1_ACAGCTCAGAGA1-GC1‘ATTC。r-3’)和SMR列，扩增片段长度约470bp。PCR反应体系(30pL)~H下：(5’一GCCATACACCACTCATGAATTGA-3’)，针对总菌1OxExTaqbufer(Mg)3pL，2．5mmoI，LdNTP1．5UL，的引物为BSF(5’-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG一3’)20pmol／L正反引物各0．6UL，模板DNA100ng，ExTaqSUBSR(5’—ATTACCGCGGCTGCTGGC．3’)IMJ，扩增产0。2uL，加水补足至30pL。PCR反应程序采用降落PCR：物长度分别为118bp和196bp。实时PCR过程利用SYBR@94℃预变性5min，94℃变性4OS，55℃退火40S，PremixExTaq。MII试剂盒进行，反应体系为：总体积20UL，72℃延伸30S，每个循环退火温度降低0．1℃直至包含SYBRPremixExTaq(2x)10UL，25pmol／L~I物各51．5℃，35个循环，72℃最终延伸10min。采用0．8％琼0．2UL，模板DNA0．5pL，ROXReferenceDye(50x)脂糖凝胶电泳检~JPCR扩增效果。0．4pL，加灭菌去离子水至20uL。将上述体系置于96-~L板，PCR扩增产物的变性梯度凝睃电泳Ocodew基置于于ABI7500FAST实时定量PCR仪上进行自动化扩增因突变检测系统对PCR扩增产物进行变性梯度凝胶电泳电反应。PCR扩增标准程序为：95℃预变性10S，95℃变性泳检测。其中配制的聚丙烯酰凝胶浓度为6％。变性剂浓度5S，60℃退火20S，72℃延伸31S，；~-40个循环。每个反梯度为30％~j60％(100％的变性剂为7mol／L尿素~1340％去应重复3次取荧光强度平均值，进而确定变形链球菌与总菌离子甲酰胺的混合物)。取PCR扩增产物5UL和等量上样缓的相对数量。冲液混合后加入上样孔，在电泳温度60℃条件下，150V数据分析：采用quantityone4．6软件进行变性梯度凝电压下电泳6h，电泳结束后，利用0．1％硝酸银溶液对凝胶电泳图谱条带和荧光原位杂交图谱的数字化处理，采用胶进行银染染色，利用透射扫描仪进行染色后的凝胶扫描Shannon—Wiener多样性指数~1Simpson多样性指数表征以获取变性梯度凝胶电泳图谱。牙菌斑内微生物的菌群丰度。利用SPSS17．0软件对不同变性梯度凝筏电泳图谱目的条带的克隆涌摩蓑龋敏感儿童微生物指标的组间比较进行Newman．Keuls性梯度凝胶电泳图谱上的目的条带，提取其中的DNA，作检验，检验水准a=0．05，P<0．05为差异有显著性意义。为PCR的模板进行PCR扩增。采用上海华舜生物工程有限公司的小量胶回收试剂盒进行PCR产物纯化，连接到2结果ResultsPMD．19T载体上进行克隆测序，测序过程由上海生工生物2．1不同龋敏感儿童GIC表面牙菌斑内微生物群落结构工程有限公司完成。测序结果提交至GenBank数据库，利分析采用变性梯度凝胶电泳技术分析不同龋敏感儿童牙用Blastn算法进行测序结果的序列比对，确定各个条带所菌斑内的微生物群落结构，结果如圈1_3所示。结果表明：代表微生物的菌属信息。无龋组、中龋组和高龋组牙菌斑样品经变性梯度凝胶电泳分GIC表面牙菌斑内微生物群落的荧光原位杂交分析：析后均分离出数目不等的电泳条带，每个独立分离的条带可选取每名儿童的另一份牙菌斑样品，利用Streptococcusspp．认为是一个操作分类单元(operational~xonomyunit，特异性探针STR4O5f5’一TACCCGTCCCTTTCTGGT-3’，OTU)。无龋组儿童牙菌斑样品分离出的微生物群落优势菌Cy5标记，红色)和细菌通用探针EUB338(5’一GCTGCC属为37个OTUs，显著高于中龋组(24个OTUs)和高龋~N(21TCCCGTAGGAG％3’，FITC标记，绿色)进行牙菌斑内微个OTUs)，说明无龋组牙菌斑样品中微生物种类显著多于中生物群落的荧光原位杂交分析【1。将牙菌斑样品置于含龋组和高龋组。对这3组牙菌斑样品中，变性梯度凝胶电泳40g／L多聚甲醛的PBS中4℃固定12h。在37℃条件下，利图谱显示均出现了某些微生物的大量富集现象。ISSN2095—4344cN21．1581，RcoDEN：zLKHAH4045\n\n\n刘莉霞等不同龋敏感n童牙蘸斑内微生物群落的分子生态学特点一一生物特性成为预防及治疗龋病的重中之重。传统上进一步加速了龋病的发展过程【3。采用的微生物检测分析方法一般依据细菌形态、生理生通过对变性梯度凝胶电泳图谱的序列测定及比对，可化特性及免疫血清分型，不但准确性差、费时费力，而以得知其中与龋病发展过程密切相关的功能微生物。且由于牙菌斑内能够被培养、分离和纯化的细菌不到Streptococcusspp．~DActinomycesspp．在高龋组中大量50％，若以此来代表牙菌斑内的复杂微生物群落将导致存在，可能是导致龋病的关键微生物种群。而在荧光原位极大的误差。近年来，现代分子生态学逐步发展，并被杂交图谱中，Streptococcusspp．在无龋组、中龋组和高龋引入到口腔微生态学研究中，通过有效解析口腔内复杂组中数量比例亦呈现逐渐升高的趋势。研究表明：微生物群落与重要的功能微生物菌群，将口腔微生物学Streptococcusspp．为革兰阳性产酸菌，能很快酵解糖产研究领域带入了一个革命性的新时代。叭。酸，由于其产酸速度较口腔中其他细菌快，因而一直以来在龋病形成的病因机制方面，目前存在3个学说，即菌的研究都认为Streptococcusspp．与龋病关系密切。8‘。。此斑特异性假说，非菌斑特异性假说和菌斑生态假说I”。菌外，其中的Streptococcusspp．中的Streptococcusoralis、斑特异性假说提出只有少数特异性菌种，如Streptococcusmitis、Streptococcussobrinus、Streptococcusmutans和Streptococcussobrinus在龋病发Streptococcusmutans等常被认为是口腔中最早定植的展中起积极的作用，非菌斑特异性假说主张龋是多种较活“先锋菌”，这些链球菌菌种亦具有相应的致龋能【40】。在跃的细菌共同作用的结果，而菌斑生态假说则认为与龋相Actinomycesspp．中，Actinomycesviscosus和关的细菌基本都是口腔正常菌群，因局部口腔环境变化致Actinomycesnaeslundii是早已证实的关键致龋菌【41】。此使微生态失衡，从而成为条件致病菌而引起龋病【3z。】。本外，有研究报道认为Actinomycesspp．和Streptococcus实验通过分子生态学技术发现：在牙菌斑中不是单独一种spp．一起参与对牙釉质的第一阶段黏附作用，对龋病的发特异细菌，而是一组微生物功能菌群与龋病的发生有显著生起重要作用。由于Actinomycesspp．是厌氧性细菌，在性关系。牙菌斑中多种细菌相互作用，使整个微环境从平菌斑形成后优先选择寄宿到菌斑的深处缺氧层，同时在缺衡向生态失调发展，最终形成龋病。氧的环境下能产生乳酸，因此能作用于牙釉质产生脱矿化在本实验中，通过对不同龋敏感儿童牙菌斑内微生作用，进而慢慢腐蚀牙齿】。物群落的变性梯度凝胶电泳分析，以及基于变性梯度凝此外，Neisseriaspp．在3组牙菌斑样本中都大量检出，胶电泳图谱的条带数量，Shannon．Wiener多样性指数和目前，Neisseriaspp．与龋病的关系尚不很清楚，由于一些Simpson多样性指数分析，可以发现无龋组儿童牙菌斑样Neisseriaspp．能产酸，其产生的多糖荚膜可以使无荚膜的品内微生物群落结构最为复杂，具体表现为微生物多样细菌集聚，有研究表明Neisseriaspp．与致龋菌性丰富，大多数菌群在微生物群落中的相对数量较少，Streptococcusmutans可相互集聚[43-44】。此外，奈瑟菌还而中龋组和高龋组的微生物群落较为简单，这个研究与可以促进厌氧菌的生长。因此认为Neisseriaspp．可能普遍之前研究结论相一致，Li等p】采用变性梯度凝胶电泳技术存在于牙菌斑中，对菌斑的形成和龋病的发生中起了一定研究了重症早期龋患儿口腔中微生物群落结构，结果表作用。无龋组、中龋组和高龋组中还有Veillonellaspp．和明相对于重症早期龋患儿，无龋儿童菌斑中微生物群落Lactobacillaspp．检出。研究表明，Veillonellaspp．的数量结构更加复杂。刘怡然等【35】采用变性梯度凝胶电泳技术和Streptococcusspp．数量有着非常密切的联系，检测早期儿童龋治疗前后口腔菌群多样性。结果表明治Veillonellaspp．中的一些种，比如Villonellaalcalescens可疗前唾液样本变性梯度凝胶电泳条带数显著少于治疗以与Streptococcusmutans相互促进，加速龋病的形后，且该差异有非常显著性意义(P<0．01)。以上研究成J。Lactobacillaspp．~]Streptococcusspp．同属于厌表明，种群类型丰富的牙菌斑微生物群落往往不会导致氧产酸菌，被认为是引起龋病的主要细菌，在先前一些研龋病的发生。究中发现大量Lactobacillaspp．和Streptococcusspp．存在另一方面，若多种微生物在牙菌斑内保持的动态平衡于龋病中】。被打破，微生物类群之间原有的种间协同或拮抗作用逐渐此外，本实验采用实时定量PCR考察不同龋敏感儿童减弱，此时即会导致微生物菌群失调，使其中的致龋菌等牙菌斑样本内Streptococcusmutans占总菌的相对数量，可微生物大量富集，从而使此处位点向龋病状态转化l36J。在知高龋组中Streptococcusmu~ns占总菌的数量最高，其本实验中，中龋组和高龋组样品中均出现了某些微生物的次为中龋组，无龋组中Streptococcusmutans的数量最少。大量富集作用，这些微生物可能在龋病的发生发展过程中变异链球菌做为龋病的主要致病菌，其致龋机制已基本明起关键作用。从口腔微环境改变的角度而言，龋病的进展确[48-49】，其存在数量已成为龋齿活跃性评估以及疾病状态检过程中牙菌斑会逐渐酸化。随着牙菌斑pH值的不断降低，测的指标[50-58l。梁景平¨利用实时定量PCR对牙菌斑中只有能耐受低pH值的细菌能在酸性条件下存活而不断增Streptococcusmu~ns进行定量检测，发现Streptococcus殖，这些微生物往往具有利用碳水化合物进行产酸的能力，mutans在高龋组中占总菌的比例高于无龋组(P<0．01)，P．O．Box10002，Shenyang110180www．CRTER．org4048\ni莉霞，等．不同龋敏感儿童牙菌斑内微生物群落的分子生态学特点WWW．CRTER．org说明实时定量PCR可作为一种有效的细菌定量检测手段应【16】RubyJ，GoldnerM．Natureofsymbiosisinoraldisease．JDentRes．2007；(11：8．用于致龋菌的定量分析过程。[17】McBainAJ，BartoloRG，CatrenichCE，eta1．Growthandmolecularcharacterizationofdentalplaquemicrocosms．J者陈琳进行实验设计，实验实施为刘莉霞，实验评ApplMicrobio1．2003；94：655-664．估为陈琳，资料收集为刘莉霞，陈琳成文，刘莉霞审校，刘莉霞【18】FujimotoC，MaedaH，KokeguchiS，eta1．Applicationofdenaturinggradientgelelectrophoresis(DGGE)tothe对文章负责。analysisofmicrobialcommunitiesofsubgingivalplaque．J苟矽长文章及内容不涉及相关利益冲突。PeriodontRes．2003；38：440-445．伦理要儿童监护人对实验知情同意。【19】RudneyJD，PanChenR．Streptococcaldiversityinoralbiofilmswithrespecttosalivaryfunction．ArchOralBio1．2003；存龋病一是一种由牙菌斑内包括致龋菌在内的多种细48：475-493．菌共同作用而导致的慢性感染性疾病。【20】RasiahIA，WongL1AndersonSA，eta1．Variationinbacterial考芦溯：文章为原创作品，无抄袭剽窃，无泄密及署名和DGGEpatternsfr0mhumansaliva：overtime．between专利争议，内容及数据真实，文责自负。individualsandinc0rrespOndingdentalplaquemicrocosms．ArchOralBio1．2005；50：779—787．[21]Lj丫SaxenaD，BarnesVM，ela1．Polymerasechainreaction—4参考文献Referencesbaseddenaturinggradientgelelectrophoresisintheevaluation【1】王瑾，程为庄．玻璃离子水门汀的研究进展【J】_北京生物医学工程，oforalmicrobiota．OralMicrobiolImmuno1．2006；21：333—339．2005，24(2)：139-143．【22】L』KuCYS，XuJ，eta1．Surveyoforalmicrobialdiversityusing【2】ForstenL_Resin-modifiedglass·ionomercementsfluoridePCR-baseddenaturinggradientgelelectrophoresis．JDentreleaseanduptake．ActaOdontoScand．1995；53：222-225．Res．2005；84(6)：559—564．【3】AasJA，PasterBJ，StokesLN，eta1．Definingthenormal【23】姜云涛，梁景平，李超伦，等．不同龋敏感儿童牙菌斑内口腔链球菌bacterialfloraoftheoralcavity．JClinMicrobio1．2005；43(11)：的PCR·DGGE分析【J】_上海交通大学学报：医学版，2007，27(2)：5721．5732．133—136．【4】MarshPD，BradshawDJ．Physiologicalapproachestothe【24】LiIsmailAI，Geeta1．Similarityofbacterialpopulationsincontroloforalbiofilms．AdvDentRes．1997；11(1)：176-185．salivafrOmAfrican-Americanmother-childdyads．JClin【5】BeightonD．ThecomplexoralmicrofloraofhighriskMicrobiol_2OO7：45(9)：3082—3085．individualsandgroupsanditsroleinthecariesprocess．【25】RocasIN，SiqueiraJF,AboimMCReta1．DenaturinggradientCommunityDentOralEpidemio1．20O5：33(4)：248-255．gelelectrophoresisanalysisofbacterialcommunities[6】PennisiE．Amouthfulofmicrobes．Science．2005：307(5717)：associatedwithfailedendodontictreatment．OralSurgOral1899．1901．MedOralPatholOra1．2004；98(6)：741·749．【7】LiJ，HelmerhorstEJ，LeoneCW．eta1．Identificationofearly【26】SiqueiraJF,RocasIN，RosadoAS．Investigationofbacterialmicrobialcolonizersinhumandentalbiofilm．JApplMicrobio1．communitiesassociatedwithasymptomaticandsymptomatic2004；97(6)：1311-1318．endodonticinfectionsbydenaturinggradientgel[8]CowanD，MeyerQ，ffrdW，eta1．Metagenomicgeneelectrophoresisfingerprintingapproach．OralMicrobioldiscovery：Past，presentandfuture．TrendsBiotechno1．2005；lmmun01．2004；19：363—370．23(6)：321—329．【27】MachadodeOliveiraJC，SiqueiraJF,RocasIN，eta1．Bacterial[9】MuyzerG，SmallaK．Applicationofdenaturinggradientgelcommunityprofilesofendodonticabscessesfr0mBrazilianelectrophoresis(DGGE)andtemperaturegradientgelandUSAsubjectsascomparedbydenaturinggradientgelelectrophoresis(TGGE)inmicrobialecology．AntonieVanelectrophoresisanalysis．OralMicrobiolImmunOI．2007；22：Leeuwenhoek．1998；73(1)：127-141．14．18．【10】PalmerC，BikEM，EisenMB．Rapidquantitativeprofilingof【28】PasterBJ，BochesSK，GalvinJL1eta1．Bacterialdiversityincomplexmicrobialpopulations．NucleicAcidsRes．2006；humansubgingivalplaque．JBacterio1．2001；183(121：34(1)：e5．3770—3783．【11】WorldHealthOrganization．OralhealthsurveysBasic【29】ZijngeV，HarmsenHJM，KleinfelderJW，eta1．DenaturingMethods．4thed．Geneva：WorldHealthOrganization．1997：gradientgelelectrophoresisanalysistostudybacterial1．21．communitystructureinpocketsofperiodontitispatients．Oral【12】NuebelU，EngelenB，FelskeA．SequenceheterogeneitiesofMicrobiolImmuno1．2003；18：59—65．genesencoding16SrRNAsinpaenibacilluspolymyxa【30】LedderRG，GilbertP,HuwsSA，eta1．MolecularanalysisofthedetectedbytemperaturegradientgelelectrophoresisJsubgingivalmicrobiotainhealthanddisease．ApplEnvironBacterio1．1996；178：5636-5643．Microb．20O7：73(2)：516—523．[13】刘靖，王韦玮，胡凡，等．荧光原位杂交观察13腔原位菌斑中链球菌【31】于淼，仪虹，孟玲娜，等不同龋状况母子问13腔微生物群落结构分和具核梭杆菌的动态变化的研究【J】_1：3腔医学，2012，32(1)：析【J】_13腔医学研究，2010，26(3)：387—390．15．18．【32】LoescheWJ．Thespecificplaquehypothesisandthe【14】梁景平，姜云涛，李超伦，等．实时PCR技术在龋易感儿童牙菌斑致antimicrobialtreatmentofperiodontaldisease．DentUpdate．龋菌定量检测中的应用[J】．上海交通大学学报：医学版，2007，1992；19：68-74．27(2)：128-132．[33】MarshPD．Microbialecologyofdentalplaqueandits【15】LedderRG’GilbertP,PluenA，eta1．Individualmicroflorabegetsignifcanceinhealt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