微生物生态学-11基因工程菌的标记与跟踪

基因工程菌株的标记与跟踪\nGFP基因1、绿色荧光蛋白的来源荧光现象在许多海洋无脊椎动物中普遍存在着。许多刺胞亚门的动物（绿色荧光）和几乎所有栉水母类的动物（蓝色荧光）在受到刺激时都可以发出荧光。1962年，Shimomura和Johnson等人首先从水螅水母类动物AequoreaVictoria中分离、纯化出一种荧光物质，称为绿色荧光蛋白(GreenFluorescentProteins，GFPs)。目前研究得较为深入的是来自多管水母科(Aequorea)和海紫罗兰科(Renilla)的荧光蛋白，即AequoreaGFP和RenillaGFP(A-GFP和R-GFP）。\n2、GFP的特性：A-GFP是球状的蛋白质，分子量为27-30KDa的单体，最高吸收峰为395nm，肩峰为473nm，发射光谱是λmax=508-509nm。生色团的形成首先是Gly67的氨基对Ser65的羰基亲核进攻而环化成五元环，同时失去一分子水形成咪唑基。在有氧条件下，新的N=C双键促进Tyr66的α、β-氧化脱氢，从而形成一个连续的π电子芳香族系统-生色团。\nGFP生色团形成示意图(3和4表示不同pH条件下的两种形式,4和5是同分异构体)成生色团。\n3荧光特性首先，仅以蓝光或紫外光照射GFP就能激发其荧光，并不需要外加任何底物或共作用因子；荧光稳定，不易衰退，只有在过热(>65℃)、过酸(pH<4)、过碱(pH12-13)或其它变性剂(如6M胍基盐酸)存在的条件下GFP才会变性，荧光消失。当变性条件去除后，49%-90%以上的蛋白质能够很快复性。更重要的是，它们在很大的pH范围内(pH7-12.2)的吸收、发射光谱也是相同的。GFP基因的表达并没有物种、细胞种类、位置的限制，而且GFP不论在真核细胞还是原核细胞中表达后，在蓝光照射下都能产生强烈荧光。\n4、绿色荧光蛋白的优缺点GFP是迄今为止唯一一种活体报告蛋白，其作用是任何其它酶类报告蛋白无法比拟的。（1）GFP的优点：检测方便：因为GFP荧光反应不需要外加底物、酶或其它共反应因子，GFP发射的荧光用肉眼或荧光显微镜就可以检测到，不会损伤正在生长的细胞和组织。荧光稳定：GFP对光致漂白作用有强烈的耐受性，能耐受长时间光照，从而延长了可探测时间。无毒害：GFP对生活细胞基本无毒害。共用性和通用性：GFP的表达几乎没有受体范围的限制，在原核和真核生物中都获得了成功的表达，是一种在生物界较为“通用”的基因。其次，因为GFP较小，只含有238个氨基酸，编码GFP的基因序列也较短，所以它可以很方便地同其它序列一起构建多种质粒，而不至于使质粒过大影响转化频率。\n（2）GFP的缺点：正因为其荧光反应不是酶反应，所以GFP的检测不是很灵敏，而且不易对其荧光进行定量测定。GFP基因的表达可能有假象存在：细胞本身存在一些可以受光激发的物质，能产生一定量荧光。\n5、GFP的用途：（1）GFP基因可以作为遗传标记和报告基因；（2）GFP可用作定位标记；\nGFP标记降解菌的生态学研究\nDLL-1菌启动子的筛选和GFP标记载体的构建DLL-1总DNAA：λ-DNA/HindⅢmarkerB-D：ThetotalDNAofDLL-1DLL-1总DNA的酶切A：DLL-2000markerB：ThetotalDNAofDLL-1C-E：Sau3AⅠdigestionofDLL-1甲基对硫磷降解菌DLL-1的GFP发光基因标记\n质粒基因文库质量检测V:λ-DNA/HindⅢmarkerU:pRobe-GFPA~T:theplasmidsofthewhitecolony基因组文库的质量检测从以上的质粒电泳均可断定外源片段的插入率为90%。说明所建文库是高质量的，足以满足普通基因文库的构建工作。\n在紫外灯下发光的绿色菌落启动子的筛选\nGFP标记载体的构建45号阳性克隆pIJGFP-45pTRGFP-45pBBRGFP-45\nGFP标记载体的构建45阳性克隆pIJGFP-45pTRGFP-45pBBRGFP-45(10倍功率）\n用新构建的标记载体对甲基对硫磷降解菌DLL-1进行GFP发光基因标记菌落在紫外灯下的发光检测(LB)A:DLLBR-45B:DLL-1菌落在紫外灯下的发光检测(LB)A:DLL-1B:DLLTR-45pBBRGFP-45pTRGFP-45DLL-1的标记与验证\nDLLBR-45的激光共聚焦显微镜荧光单细胞照片及荧光强度分析DLLTR-45的激光共聚焦显微镜荧光单细胞照片及荧光强度分析pBBRGFP-45pTRGFP-45(33倍功率）\n甲基对硫磷降解的紫外扫描图谱CK（箭头所指）2.TreatmentDLL-1(黑线)3.TreatmentDLLBR-45(红线)标记前后的性状比较降解性状的比较\nGFP基因标记的甲基对硫磷降解菌DLLBR-45在土壤及青菜中的定殖研究定殖检测方法1：共聚焦激光扫描显微镜观测定殖状况施菌20d后观察根部的定殖状况，处理的须根和土壤有明显的绿色荧光，而对照只有较弱的自发荧光。放大1000倍时可以直接观察到有大量发光菌聚集在根表面，而对照并没有。土壤来源:小卫街菜地\n植株根际土壤的激光共聚焦扫描图片A:treatmentB:CK\n将植株的根部和茎部分别横切，取多个横切面，放大400倍再观察，发现处理维管束细胞间有发光菌落的定殖，而对照没有。根横切面茎横切面\n青菜叶柄切面的激光共聚焦扫描图片A:叶柄纵切面B:叶柄横切面\n可见光紫外光定殖检测方法2：植株纵剖面平板检测\n定殖检测方法3：植株研磨捣碎涂布平板检测植株根内DLLBR-45的检测A：CKB：treatment\n回收的发光菌质粒图谱和酶活验证A:λ-DNA/HindⅢmarkerB：recoveredstrainC：inoculatingstrain水解酶活性\n根外土壤中DLLBBR-45的检测土壤中DLBBR-45的检测A：CKB：treatment