山黧豆毒素β-ODAP的生态学功能及应用-论文

应用生态学报2014年4月第25卷第4期ChineseJournalofAppliedEcology，Apr．2014，25(4)：1197-1205山黧豆毒素-ODAP的生态学功能及应用；lc熊俊兰白雪AsfaBATOOL孔海燕谭瑞碉王亚馥李志孝熊友才一(兰州大学生命科学学院／草地农业生态系统国家重点实验室／干旱农业生态研究所，兰州730000)摘要山黧豆是一种具有广谱抗逆性且营养丰富的豆科作物，但其含有p—N一草酰-L．仅，p一二氨基丙氨酸(B．N．oxaly1．L．仅，13-diaminopropionicacid，13-ODAP)神经毒素，人畜长期大量食用会导致神经性中毒，因此限制了山黧豆种质资源的利用．本文综述了干旱胁迫下山黧豆毒素p-ODAP对植株渗透调节和生长调节的影响，以及p—ODAP的分析方法、毒理机理和实用价值方面的研究进展，并对低毒和无毒品种选育策略进行了总结．干旱胁迫下，山黧豆合成大量毒素B．ODAP，其含量随胁迫程度增强而逐渐升高．B．ODAP可为植株生长和种子发育提供氮源，并积极参与清除活性氧过程，作为小分子可溶性氨基酸参与渗透调节，作为锌离子转运体参与根瘤发育．而含硫氨基酸(甲硫氨酸和半胱氨酸)含量升高可使山黧豆毒性显著降低．近年来，在山黧豆种质资源收集、杂交育种，以及通过组织培养和基因操作等技术进行低毒或无毒山黧豆品种选育方面做了大量工作．B—ODAP可通过破坏细胞内Ca“稳态和作为谷氨酸类似物引发兴奋性中毒，但在止血和抗肿瘤等方面有重要的药用价值．关键词山黧豆3-N．草酰．L一仅，B一二氨基丙氨酸神经毒素生态学功能干旱适应性文章编号1001—9332(2014)04—1197—09中图分类号Q194文献标识码AEcologicalfunctionandapplicationoftoxin~ODAPingrasspea(Lathyrussativus)．XIONGJun-lan，BAIXue，BATOOLAsfa，KONGHai-yan，TANRui—yue，WANGYa—fu，LIZhi-xiao，XIONGYou—cai(SchoolofLifeSciences~StateKeyLaboratoryofGrasslandAgro—ecosystem~InstituteofAridAgroecology，LanzhouUniversity，Lanzhou730000，China)．一Chin．App1．Eco1．，2014，25(4)：1197—1205．Abstract：Grasspea(Lathyrussativus)isalegumewithvariousadverseadaptabilityandrichnu-trition．However，itcanleadtothehumanandanimalneurotoxicityafterlong—termconsumptionduetoitsneurotoxin，3-N-oxalyl-L一，p—diamin0propionicacid(3-ODAP)，limitingitsutilization．ThispapersummarizedtheinfluencesofB．ODAPonosmoticadjustmentandgrowthregulationingrasspeaunderdroughtstress，theresearchprogressinanalysismethods，toxicologicalmechanismsandpracticalutilityofp—ODAP，andthebreedingstrategiesforlow-andzero—p—ODAP．B-ODAPsynthesiswasfoundtobeabundantingrasspeaunderdroughtstressanditscontentwasenhancedgraduallywiththeincreasingextentofdroughtstress．B—ODAPcouldsupplynitrogenforplantgrowthandseeddevelopment，scavengereactiveoxygenspecies(ROS)，involveinosmoticadjust-mentasasolubleaminoacid，transportzinc-ionsasacarriermolecule，andimpactnoduledevelop—ment．However，increasingthecontentofsulfur—containingaminoacids(methionineandcysteine)coulddecreasetheleveloftoxicityofgrasspea．Therewerealotofinvestigationsoncollectingge—neticresources，crossbreeding，tissueculture，andgenemanipulationforlow-andzero—toxiningrasspeainrecentyears．Although13-ODAPcouldinduceexcitotoxicitybydamagingintracellularCahomeostasisandasglutamateanalogues，ithasmedicinalvalueonhemostasisandanti．tumor．Keywords：Lathyrassativus；13-N—oxalyl—L一，13-diaminopropionicacid(B—ODAP)；neurotoxin；ecologicalfunction；droughtadaptability．高等学校博士学科点专项科研基金项目(20110211110022)、国家自然科学基金项目(31070372)、国家公益性行业(气象)科研专项子课题(GYHY201106029-2)和教育部直属高校海外名师项目(Ms2011LZDX059)资助．}通讯作者．E—mail：xiongyc@lzu．edu．cn2013-0619收稿，2013—11．11接受．\n应用生态学报25卷山黧豆(Lathyrussativus)是豆科山黧豆属一年可以促进B—ODAP合成．有研究进一步指出，生作物，其营养丰富，包括蛋白质、脂肪、碳水化合ABA可以通过增加多胺(spermine，Spm)含量促进物、淀粉和氨基酸等¨J．山黧豆籽粒的蛋白含量高p．ODAP合成‘1引．以高毒品种(Jamalpur)和低毒品达18．2％～34．6％，且富含17种氨基酸j．山黧种(LS8603)为材料研究发现，山黧豆低毒品种对干豆对环境有广泛的适应性，能在干旱、盐碱和水涝等旱更敏感，干旱使低毒品种积累更多的B-条件下生长良好J．山黧豆还有很强的固氮能力，ODAPl2．低毒品种往往表现为低产和抗逆性弱，在可作为先锋作物种植于贫瘠地区，并与其他粮食作低毒品种选育过程中，虽然暂时能够得到低B—物轮作，特别适宜于我国西北干旱、高寒和贫瘠的丘ODAP含量且高产的品种，但随着时间的延长，其毒陵山区、黄土丘陵沟壑区．随着人们对蛋白食物素含量往往会增加．因此，有研究指出，山黧豆极强要求的日益提高，山黧豆作为一种亟待开发的植物的干旱适应性与B—ODAP有关，并尝试了解p·蛋白质库和可持续农业的模式作物引起了越来越多ODAP参与干旱的适应机理”．的重视．2B-ODAP的生态学功能山黧豆被广泛种植于世界各地，但是它含有的一种非蛋白质氨基酸13-N．草酰．L．，3-二氨基丙氨B—ODAP可能在山黧豆生长和广泛适应性特别酸(B—N—oxalyl—L-o【，p-diaminopropionicacid，p—是干旱方面有着重要作用，其中，B—ODAP与氮源、ODAP)限制了其发展“J．人畜过度食用山黧豆会活性氧、渗透调节和根瘤发生的关系研究最为多见．导致不可逆瘫痪，B-ODAP已经成为开发和利用山2．1B．ODAP与氮源的关系黧豆的主要障碍¨．目前，对于山黧豆毒素($．氮是影响植物生长和产量的重要因素，从种子ODAP)的去除、开发和利用方面已有大量研究．有萌发到后期种子形成，氮素的转移和利用非常频繁．研究表明，随着B．ODAP含量的降低，山黧豆的抗逆种子萌发过程中，氮素会大量转移用于苗期生长，随性(特别是耐旱性)和产量都会降低_1．B．ODAP是着叶片的衰老和光合能力的下降，营养器官中氮素山黧豆抗逆性的生态指示因子J．本文综述了从山开始向繁殖器官转移_2．而山黧豆B—ODAP的大量黧豆传统育种到现代生物技术开展的低毒和无毒品合成主要集中在2个时期：种子萌发和种子形成．有种选育以及种质资源利用情况，并总结和讨论了B．研究推测，作为一种氨基酸(图1)，B—ODAP可以高ODAP的生理生态意义．效率地转运氮，B．ODAP作为氮库，在萌发和蛋白分113-ODAP可作为干旱胁迫下山黧豆抗逆性的生解后可供应必要的氮源使山黧豆植株生长．20世纪化指标9O年代发现，少量施用氮肥可以逐渐降低山黧豆B—ODAP含量；在缺素试验中，培养液分别缺乏N、Zn、山黧豆有很强的抗逆性，如干旱、盐碱和水涝Mo和Mn元素，山黧豆茎、根中8．ODAP含量高于等，但是关于B．ODAP与抗逆性关系的研究多集中对照组，其中缺乏氮素影响最大，说明氮素可显著影在干旱适应性方面．有研究表明，山黧豆具有极强的响山黧豆B．ODAP含量．耐旱性，能在干旱甚至年降雨量<300mm的地区生2．2B．ODAP与活性氧的关系长良好_l．其原因可能是，山黧豆有很多形态学方干旱胁迫初期，植物活性氧(reactiveoxygen面的优势，如披针形叶片、发达的根系和大量的分枝species，ROS)会增加并以第二信使存在，随着胁迫等．但也有研究发现，其干旱适应性与B．ODAP程度的增加，ROS积累从而对细胞产生毒害作用，有关．例如，干旱胁迫下山黧豆B．ODAP含量大量增引发膜脂过氧化反应，使细胞代谢失衡．有研究加．用20％聚乙二醇(polyethyeneglycol，PEG)证实，B．ODAP有清除ROS的作用：外源施加羟自由600对山黧豆幼苗进行模拟胁迫，B．ODAP含量显著基会增加B—ODAP含量，外源施加B—ODAP可以降上升，PEG处理24h后B—ODAP含量是未胁迫组的1．9倍．外源施加脱落酸(abscisicacid，ABA)可H。。cNA-~C。。H以促进B-ODAP合成，聚乙二醇(PEG)、PEG+ABA、HH：ABA处理山黧豆幼苗后，其叶片B．ODAP含量均显著增加，外源施加ABA后，B．ODAP增加出现2个图113-ODAP的化学结构式时间点，且滞后于ABA含量的增加，因此推测ABAFig．1Chemicalstructuralformulaof~-ODAP\n4期熊俊兰等：山黧豆毒素B—ODAP的生态学功能及应用低羟自由基含量；在PEG处理15d的山黧豆幼苗中黧豆引发中毒的主要成分B．ODAP后，B．ODAP的加人HO2抑制剂二乙基二硫代氨基甲酸钠(diethyl—分析方法得到了快速发展，经历了从定性分析到定dithiocarbamate，DDC)和促进剂氨基三唑(aminotri．量分析的转变．定性分析可以快速有效地检测B．azole，AT)后，发现DDC可降低叶片-ODAP含量，ODAP，在山黧豆早期应用中起到重要作用，其包括AT导致B—ODAP积累131．山黧豆不同组织中纸层分析法、薄层色谱法、化学显色法、酶法、分光光-ODAP的聚集与低水平的02和H202相关[1。l2．度法和电泳技术等．虽然定性分析简单易行，但B—ODAP清除ROS的机制需要更深人的研究，如使是其无法精确且有效地提取和鉴定B—ODAP的理化用突变体等，已有研究应用^y射线在山黧豆中筛选性质和结构，因此创建了很多定量方法，包括高压液出了活性氧清除剂抗坏血酸的缺失突变体并测定了相色谱法、毛细管电泳法、流动注射分析法和质谱分其抗氧化能力，因此可通过测定干旱胁迫下该突析法等．这些技术为揭示o【．ODAP和B．ODAP异变体p—ODAP含量变化进一步分析B．ODAP积累与构体及二者互变机理，测定不同基因型的山黧豆、不活性氧的耦合关系．同自然分布的山黧豆居群和不同方法加工处理的山2．3B—ODAP与渗透调节的关系黧豆制品中B—ODAP含量，以及鉴定蛋白质氨基酸脯氨酸是逆境下植物保持水分、进行渗透调节和非蛋白质氨基酸种类及性质等提供了支持．的重要物质之一．正常环境下，植物脯氨酸含量很3．2B—ODAP的毒理学机理低，干旱胁迫下其含量会大量增加．目前发现，所有1986年，Spencer等证实B．ODAP是人畜山氨基酸中只有脯氨酸能清除ROS_29]．B．ODAP作为黧豆神经性中毒的主要因素后，许多学者意识到，开一种非蛋白质氨基酸，虽然与脯氨酸不同，但因其在展这种非蛋白质兴奋性氨基酸(excitatoryamino干旱胁迫下大量聚集，有研究认为其不仅可以清除acid，EAA)神经性中毒的分子机理研究有重大意活性氧，还能参与渗透调节_l．然而，虽然干旱胁迫义．早期采用小白鼠、雏鸡和羊等多种动物模型饲喂下B—ODAP含量有所增加，但其增幅远低于脯氨酸，p—ODAP试验表明，p-ODAP经过血循环，透过血脑这对其渗透调节作用产生质疑．屏障(blood．brainbarrier，BBB)选择性滞留于神经2．4B-ODAP与根瘤生长和锌转运的关系组织并伤害靶器官——中枢神经系统(centrenerv—山黧豆B．ODAP积累可能与其苗期根瘤发育相OUSsystem，CNS)，导致脑和脊髓神经细胞膜受损关，虽然B．ODAP并非根瘤菌的营养成分，但是低浓伤，线粒体嵴崩解，部分神经细胞出现细胞坏死或凋度．ODAP可以提高根瘤菌的结瘤能力．在生长亡_3J．B—ODAP可透过血脑屏障后在中枢神经系统前期，山黧豆能向根际分泌B．ODAP，p．ODAP对微中积累，随后向腹膜和静脉内渗入，同时诱发一系列生物和动植物有普遍的毒性，能使山黧豆幼苗更好神经性中毒症状．近几年，随着分子生物学及其地生长在贫瘠的土壤中¨．有研究表明，B．ODAP相应技术的发展，对毒物作用机理的研究已从器官可以螯合锌，而土壤缺锌会使种子B—ODAP含量升水平和细胞水平发展到亚细胞水平和分子水平．要高，因此推测，B．ODAP是锌离子的运载体，可将锌从山黧豆植株根部运往地上部分卜]．另有研究表深入认识B．ODAP如何引起的危害，必须在分子水平上探讨B．ODAP与生物体内大分子之间的相互作明，在温室中，施用锌肥可以逐渐降低3个山黧豆品系的B．ODAP含量；大田条件下，选定9个山黧豆品用，以及B．ODAP如何与细胞内受体结合和导致细系，降雨量分别为260、429和405mm时，分别施加胞信号转导改变．目前，对B—ODAP神经性中毒机理0、5、10和2Okg·hmI2锌肥，相比对照籽粒中B—的阐述有：1)破坏细胞内钙稳态：B—ODAP在兴奋性ODAP含量降低10％～40％．向来源于山黧豆叶神经毒性发生早期诱导细胞内ca浓度升高，从而片外植体的愈伤组织施加锌，会减少B一异嗯唑啉-5．增加内质网．线粒体轴Ca浓度，激活细胞内许多敏酮-2-L-丙氨酸[B．(isoxazoline-5一on-2．y1)一L—alanine，感ca信号蛋白，破坏细胞骨架蛋白引起细胞损伤BIA]向p-ODAP的转化程度，而BIA是p—ODAP生坏死和程序性细胞死亡(pro~ammedcelldeath，物合成过程中的中间体．PCD)．2)阻碍配体与受体结合：B．ODAP空间结构与谷氨酸(glutamicacid，Glu)相似，可作为Glu3~ODAP的分析方法、毒理学机理和实用价值类似物影响粘附调变蛋白(adhesionmodulationpro-3．113-ODAP的分析方法teinA，AMPA)受体的激活卜．Glu作为兴奋性神自1964年印度学者Rao加分离并鉴定出山经递质广泛分布于哺乳动物的中枢神经系统，是中\n1200应用生态学报25卷枢神经系统中含量最高的一种兴奋性氨基酸，对大间、血小板聚集性、血栓素A2等方面，但还需要建脑皮层神经细胞有普遍而强烈的兴奋作用，而B—立病理动物模型进行验证．此外，有研究应用特定高ODAP有可能在中枢神经系统中竞争性结合Glu受压液相色谱法检测三七氨酸(B—ODAP)在动物血浆体，即N．甲基．D．天门冬氨酸(N—methyl—D-aspartate，内的药物代谢动力学以确切了解其药理作NMDA)受体和非．NMDA受体而诱导兴奋性神经毒用0I。．另外，[3-ODAP还可以杀死人恶性神经胶性(excito．toxicity)．3)干扰MAPK信号传递：B-质瘤细胞和小鼠纤维瘤细胞，用于防治部分肿瘤，其ODAP通过磷脂酰乙醇胺结合蛋白1(phosphatidyle-疗效高且安全．B．ODAP可以活化蛋白激酶c，为thanolamine．bindingprotein1，PEBP1)下调而影响促治疗阿尔兹海默症和提高神经元细胞长时程记忆提丝裂原激酶活蛋白激酶(mitogen．activatedproteinki—供了新思路．nase，MAPK)信号的级联反应，可以推测B—ODAP4山黧豆降毒选育进展兴奋性神经毒性可能是通过降低PEBP1表达而增加磷酸化，继而诱发关键信号蛋白而调节MAPK信从传统方法到现代生物技术，山黧豆低毒品种号级联反应．选育已经尝试了多种方法，但是低毒品种选育仍是3．3B—ODAP的实用价值山黧豆研究的难点，其原因是低B．ODAP难以稳定8一ODAP的大量合成集中在山黧豆苗期和结荚遗传．结合现代生物技术和传统的杂交育种有望突期，而这2个时期最易受动物和昆虫的啃食，B．破这一瓶颈，丰富含硫氨基酸含量则为育种学专家ODAP对动物、蠕虫和真菌等均具有不同程度的毒提供了一个新方向．性，这可能是山黧豆具有良好抗生物胁迫特性的原4．1传统杂交育种因之一_1．另外，山黧豆植株可以通过根将B—不同种和品种的山黧豆农艺性状和B-ODAP含ODAP分泌到根际土壤，在一定程度上抑制周围植量有所不同，利用种间或种内杂交可以选育低毒品株的生长，以获得更多的水分、阳光和营养等资种，而杂交的第一步就是种质资源的收集和评估．早源．可见，B．ODAP可以起到主动防御和被动调在20世纪60年代就有研究所对山黧豆种质资源进控的双重作用，是山黧豆进化上的一种选择．山黧豆行收集和评估，到目前为止，已经有加拿大、智利、埃是一种具有广泛耐受性的豆科作物，其极强的抗逆塞俄比亚、法国和印度等多个国家参与，位于罗马的性与p—ODAP相关，如果将调控p—ODAP的基因在国际生物多样性中心收集了世界上最多的山黧豆品富含含硫氨基酸的植物中微量表达，有可能既能增种(>4000)，叙利亚的国际旱农中心(ICARDA)保存强其抗逆性又可以无毒，这将是B．ODAP开发利用了来自超过45个国家的山黧豆属的种质材料，并且的一个重要方向．如果将毒素3-ODAP基因转移到针对其农艺性状和B．ODAP含量进行了评定31"J．其他作物中，可以进一步评价B．ODAP的生理作用兰州大学生命科学学院草地农业生态系统国家重点和调节机理．实验室于2011年参与由ICARDA发起的生物多样虽然大量长期食用B．ODAP会导致人畜神经性性与基因综合管理计划(BiodiversityandIntegrated中毒，但是研究发现3-ODAP是植物中的一种多功GeneManagementProgram，BIGMP)项目，负责高产、能代谢物，具有重要的药用价值j．人参和三七中早熟、低毒3类不同遗传特性山黧豆品种在中国西含有B—ODAP，被命名为三七氨酸(dencichine)，是北地区的繁育工作．三七止血的重要成分．有研究发现，低剂量B．分类学研究表明，只有L．amphicarpos和扁荚ODAP可以止血，高剂量3-ODAP会引发神经毒性，山黧豆(L．cicera)能与山黧豆(L．sativus)杂交，因三七氨酸(3-ODAP)可通过增加体内血小板数量止此山黧豆低毒品种的杂交选育多集中在种内¨．20血，并缩短凝血时间和出血时间如J．使用电子显世纪90年代，Wuletaw等为选育低毒山黧豆提供微镜观察发现，三七注射液(含B．ODAP)能使豚鼠了系统的方法：1)开展杂交育种项目；2)从国际种血小板伪足伸展、变形、聚集，从而破坏血小板膜，产质资源选择低毒品种；3)收集、分类和评估本地种生血小板脱颗粒等反应，进一步诱导血小板释放二的毒性和农艺性状；4)发展不同品种的抗逆性；5)磷酸腺苷(adenosinediphosphate，ADP)、血小板凝培育早熟品种．低毒品种的选育随着全球山黧豆品血因子Ⅲ和Can等止血活性物质，发挥凝血作种的收集取得了一定成功，与本地种相比能够培育用卜J．B-ODAP止血的机理包括影响凝血酶原时部分毒素相对降低的品系，如ICARDA的Wasie，其\n4期熊俊兰等：山黧豆毒素B—ODAP的生态学功能及应用1201毒素仅为0．08％．难以突破的瓶颈，因此有研究者将目光投向了现代选育好的低毒品种需要进行详细的种质资源遗生物技术，如组织培养、转基因技术和反义RNA技传多样性鉴定，方法包括直观的形态学、细胞学和生术等．化标记等．这些方法在精度和数量上均有限，且易受4．2．1组织培养和转基因技术山黧豆组织培养方环境和发育时期的影响，因此对山黧豆低毒品种选法的发展为利用无性系变异筛选低B—ODAP含量的育产生了一定限制．近2O年来，人们已成功采用山黧豆提供了可能．用含有8％或12％蔗糖的琼脂DNA分子标记技术从分子水平直接定量检测物种培养基培育了高2mm的L．articulatus，并使L．c遗传多样性，其数量丰富、遗传稳定，不受环境和发menumxL．articulatus杂交。。．以山黧豆茎尖、茎问育时期影响，方法包括限制性片段长度多态性(re。分生组织、叶盘、根、种子和体细胞为材料进行组织strictionfragmentlengthpolymorphism，RFLP)、随机培养，其中叶和根成功获得低B—ODAP含量和高产扩增多态性DNA(randomamplificationpolymorphism的材料J．利用遗传转化可以将特殊基因转入到DNA，RAPD)和随机扩增片段长度多态性(ampli—山黧豆组织中，如将载有NeomycinPhosphotransfersefledfragmentlen~hpolymorphism，AFLP)等．应用II(wptII)基因和一glucuronidase(gus)内含子的农DNA分子标记技术检测山黧豆种质资源，如Chtour．杆菌与山黧豆上胚轴段放于培养基中共同培养，应OU—Ghorbel和Lauga采用RFLP和RAPD方法鉴用GUS组织化学染色法检测，其转化率高达36％【70]定山黧豆属中地理起源和分布幅度大并有代表性的．从土壤中分离到能降解B．ODAP的菌株5个物种、9个居群之内和之间的遗传多样性水平，BYA1，将其构建到载体PUC18中并转化到山黧豆其鉴定结果与传统方法一致；利用来源于表达序列组织中”．无论是降解B．ODAP的菌株还是低毒变标签(expressedsequencetags，ESTs)和表达序列中异都可为进一步培育为稳定遗传低毒品种提供材的简单重复序列标记(EST—SSRs)研究埃塞俄比亚料_6．但是，目前应用组织培养低B．ODAP含量山黧豆种群遗传多样性，发现其所有引物平均多态的山黧豆存在很多困难，如染色体变异频率高、范围性为0．416，平均基因多样性为0．477，其范围为广、时间早，以及能降解B．ODAP的菌株很少3'J．o．205(marker：LO42)一0．804(marker：删32肺)，4．2．2根据生物合成途径改良自从1964年印度2并且该地区山黧豆变异(84％)多发生在品系个研究小组相继独立从山黧豆种子中分离和鉴定出内J．可见，DNA分子标记技术为山黧豆种质资13-ODAP以来，为了更好地培育低毒品种，探索源鉴定提供了较强的技术支持．B—ODAP的生物合成途径已经成为山黧豆研究的重目前，虽然已经成功选育了一些低毒品种，如要内容．可以通过生化突变和基因操作等技术阻断ICARDA的Wasie，但是随着时间的推移，试验田中B．ODAP生物合成过程中的重要前体物质或合成酶B．ODAP含量会上升．山黧豆杂交育种遇到了很从而降低B—ODAP含量．多困难：1)对低毒的定义模糊不清，不能清楚地界应用放射性同位素标记手段合成山黧豆p-定安全的食用浓度，近年来ICADRA将其定义为ODAP取得了较大进展．Malathi小组于1970年提出0．1％，