核酸杂交技术在微生物生态学上的应用Ξ

第20卷　第1,2期生态科学Vol120No11,22001年　6月EcologicScienceJun12001X核酸杂交技术在微生物生态学上的应用122黄立南,聂湘平,蓝崇钰(1.中山大学环境科学系,广东广州510275;2.中山大学生命科学学院,广东广州510275)摘　要:由于自然界中大部分的微生物种类到目前为止仍不可培养,传统基于培养和纯种分离的技术在研究微生物生态时面临很大障碍。分子生物学的进展为诸多长期困扰微生物学研究的问题提供了解决办法。核酸杂交技术已被证实在微生物系统分类和微生物生态等领域的研究具有巨大潜力并已被广泛应用。综述核酸杂交技术的基本原理、实际应用及其主要优点和局限性,以及提高其检测灵敏度和特异性的方法,并对该技术的应用前景作了探讨。关键词:核酸杂交;微生物生态中图分类号:Q78文献标识码:A文章编号:100828873(2001)01,220115206微生物生态学上的进展更多地是依赖于其他的物理、化学技术,而不是宏观生态学本身。由于对诸如被释放到自然环境中的基因工程微生物(geneticallyengineeredmicroorgan2isms,GEMs)等问题的关注,使科学家有必要对自然微生物生态系统进行准确而全面的研究。然而,以往对微生物生态系统的研究大都不够全面且分散,难以对自然界中微生物群落的变化进行客观的评估。传统基于微生物培养和纯种分离的技术在研究微生物生态、描述微生物群落的结构和多样性时面临巨大障碍,主要表现在:①对任何微生物类群进行描述之前必须首先对之进行培养,或先前已被成功培养。然而,各种自然生境中的微生物,[1～3]其中大部分的种类至今仍是不可培养的。通常,大部分能用显微镜观察到的微生物细[4,5]胞都是生活的,但它们并不会在培养基上发展成肉眼可见的菌落。②现有微生物分类标准的主观性。就算某些新发现的微生物种可以被培养,但也常常与现行的分类标准体系不相符,而已有的对各种微生物表型的描述也常常不能满足区分各种类群的需要。核酸杂交技术为微生物生态学的研究提供了一种强有力手段,通过它可以获得众多传统技术难以培养或鉴定的自然种群的DNA信息,在环境中跟踪特定的基因及其宿主微生物,并且可以在同一时间研究多种的微生物。利用核酸杂交技术还可以研究基因组的组织上的变化以及自然界中基因表达的调控等。1　技术原理核酸杂交的主要步骤是核酸分子的变性和选择性退火。双链DNA或处于二级结构的RNA分子被变性回复到它们原来单链、线性的形式,从而使它们处于能与互补的核苷酸链退火杂交的状态。双链DNA采用碱(如NaOH)或高温处理变性,RNA分子则通常是在甲酰胺存在的情况下通过加热使之变性。互补的核苷酸链通常是外部加入的与母板RNA序列互补的DNA链或与母板DNA互补的DNA或RNA链。外部加入的互补链若事先被标X收稿日期:2001202227;作者简介:黄立南(1971-),男,讲师;通讯联系人:蓝崇钰.\n116生态科学第20卷　记,则可以作为探针从核酸混合物中检测到与之杂交的特定的目标核酸序列。杂交实验中所用到的核酸探针通常以研究者所感兴趣而要检测的序列为基础,它们可以来自DNA、RNA、寡聚核苷酸或cDNA等。探针既可用放射性核苷酸标记,也可用共价串联到能用其它方式检测得到的非放射性分子上的核苷酸标记。这些标记物可以用切刻转移、未端标记、随机引物或PCR等方法整合到核苷酸探针的序列中去。目标核酸分子(或其所在的核酸混合样品)用Southern转移、直接过滤(slotblots)或者甚至直接固定由先前已生长在滤膜上的细菌菌落裂解而来的DNA等方法转移到硝酸纤维素膜或尼龙膜等固相支持物上。杂交完毕,将没有杂交的探针洗去,“探针-目标核酸”杂交分子便留在支持膜上。如果探针是用同位素标记的,则杂交分子可以用放射自显影技术检测;如果探针是用非放射性的方法标记的,则杂交分子可通过显色、化学发光或生物发光的方法检测。由于氢键的微弱性,互补的单链核苷酸分子经退火而形成核酸双链分子的过程是可逆的,因此可以通过改变反应的物理和化学环境(条件)从而增加核酸双链分子生成的速度、程度及其稳定性。影响两段互补核苷酸链杂交的因素包括杂交和洗膜的温度、杂交时间、离子强度、甲酰胺浓度、碱基对之间非互补的程度以及探针分子和靶核酸序列的长[6]度、复杂性和浓度等。核酸杂交主要分为液相杂交和固相杂交两种。通常,杂交在溶液(液相)中进行得比较快,所需要的探针分子的量也较少。而固相杂交中目标核苷酸序列或探针分子被固定在硝酸纤维素膜或尼龙滤膜上,其最大好处是可以分析各种不同纯度的核酸,从而可以轻易地在同一时间处理和定量多个样品,因此在目前得到广泛应用。值得一提的是,杂交试验并不要求探针与目标核酸序列之间百分之百地互补,如果需要,有限数目的非互补碱基对的存在是可以接受的。2　应　用核酸杂交技术较早时常被用于异源双链核酸分子的分析以探讨两种核酸分子之间序列的相似情况。用已知序列的单链核酸分子与未知核酸样品杂交,之后在电子显微镜下观察杂合分子上的单链(非互补)和双链(互补)区域,从而揭示了样品分子序列的情况。通[7][8]过异源双链核酸分子杂交分析检测到了内含子在基因上的位点、基因重排,以及证实[9]了可转座DNA成分的存在等。核酸杂交技术还被用于Cot和Rot杂交动力学的研究。DNA复性动力学的COT分析的基本原理是杂交速度与互补的DNA序列的浓度成正比,从而与样品中不同(非互补)序[10]列的总长度成反比,因此从复性过程的动力学参数就可推出被分析DNA样品的复杂程度,而混合样品中特定DNA序列的数量和这些序列与互补链配对、杂交复合所需的时间[11][12]有关。该法曾被用来证实真核生物基因组中重复序列家族的存在,而Torsvik等用该法研究某森林土壤样品,所得到的基因多样性是用一般分离法得到的基因多样性的200倍。相似地,通过ROT分析,一个有机体的DNA及总RNA的杂交动力学就可用于测定其[13]基因转录的数目及其相对丰度。另一个用途是DNA探针用于特定基因转录水平的定量研究。将与特定基因序列同源的DNA探针固定到滤膜上,并与提取自生活在特殊环境下的有机体的总RNA样品杂交。通常这些RNA样品事先已被放射性同位素原地(体内)标记,从而与探针DNA杂交的标\n　第1,2期黄立南等:核酸杂交技术在微生物生态学上的应用117[14]记RNA分子的数量就和相应的由特定基因转录而成的RNA分子的数量成正比。此法可以揭示环境因子是怎样控制特定基因的转录从而控制基因的表达的。利用DNA和RNA探针还可以检测、跟踪环境中特定的基因或DNA序列及其宿主微生物。正是这一应用使得核酸杂交技术在微生物生态领域能够发挥其最大潜力。杂交在精心控制的条件下进行,随后洗去没有杂交的探针,就可得到与已杂交探针同源的序列(称同源杂交,homologousprobing)。而利用从某一有机体克隆到的基因序列作为探针,通过杂交就可从另一有机体中分离到与探针相似、但不完全相同的基因序列(称异源杂交,heterol2ogousprobing)。理论上,不同的微生物类群都各自携有某些特殊的遗传信息,我们既然可以从某一个微生物有机体的基因组中检测到特定的基因,当然也能从许多微生物有机体的基因组混合物(如从环境样品中提取到的整个微生物群体的总DNA)中检测到同样的基[15]因,从而检测到携有该特定基因的微生物种的存在。这一步骤对微生物生态学意义重大,基于这一原理,基因(核酸)探针技术已被广泛应用于环境微生物样品的分析、医学临床上病原微生物和寄生性或遗传性疾病的检测与鉴定以及被释放到环境中的基因工程微生物的跟踪和监测等。由于DNA探针的检测是基于基因型而不是表型,因我们就可以直接在环境中检测到基因工程微生物或重组DNA的存在,而无需分析有关微生物的生长或重组DNA所表达的蛋白质。当前的热点是利用高度特异的寡聚核苷酸探针直接与细胞内的、或从细胞中提取出来的rRNA以及从rRNA经反转录而来的rDNA杂交,从而检测到混合样品中特定微生物的存在。不同的微生物其rRNA基因序列在某些位点会以不同的几率发生突变,但是它们本身又具有高度的保守性,形象地说,它们可以作为生物进化史的计时器,其序列的相似程度可以反映出它们在系统发育上的关系。16SrRNA分子约有1500个核苷酸,当其全序列或大部分序列(至少1000个核苷酸以上)被分析时,就可得到有关微生物在系统发育方面的足够信息并因此知道它们在系统发育上的位置,从而鉴定各种微生物。而利用基于这些信息而设计的寡核苷酸探针既可以直接在环境样品上进行原位杂交,或与浓缩富集的样品进行全细胞杂交,也可以与从环境样品中提取出的DNA或rRNA进行定量点渍杂交,或与rDNA的扩增产物或rRNA的反转录产物(cDNA)进行点渍或Southern杂交,从而可以得到特定微生物在环境中的存在、分布和丰度以及整个微生物群落的组成、结构及其多样性[1]等全面的信息。到目前为止,利用此项技术已对众多的生态样品进行了分析,并且发现[2,3,16,17]了许多新的微生物种。3　优点及其局限性利用核酸杂交技术研究环境样品中的微生物有以下优点:①核酸可以直接从样品中提取而不必通过微生物培养的步骤得到;②不管基因表达与否,都可以检测到特定的基因或核酸序列,从而能准确地跟踪、监测特定的微生物种群。通常,一份环境样品中可能只有一小部分的微生物类群在迅速生长,因而也只有一小部分的基因在活跃表达,使得核酸杂交技术的这一优点更加明显;③同一样品可以同时检测到众多不同的微生物类群。实际上,核酸杂交的检测效率正是随着所分析的微生物类群的增加而提高;④由于可以直接检测到特定的核酸序列,因此该法并不要求一定要有选择性表型(即突变衍生物),这就避免了野生种的生态适应性被营养缺陷型或反抗菌的衍生物所抵消的问题。\n118生态科学第20卷　由于RNA酶的广泛存在及其稳定性,使得RNA(尤其是信使RNA)分子要比DNA分子不稳定得多,同时,大部分分离DNA的方法所要求的碱性条件也会对RNA分子造成破坏。然而,由于rRNA被包埋于核糖体中,因而也相对较为稳定,从环境样品中分离出rRNA并用于微生物系统发育、种类鉴定、多度及多样性研究的方法已经得到全面建立和[1]应用。核酸杂交技术在环境上的应用的一个重要局限是它要比传统的方法复杂得多。从各种环境样品中提取核酸本身就包含众多繁冗的抽提和纯化操作,因而也是其中最复杂的步骤之一。而要从富含能干扰核酸检测的污染物的样品(如土壤)中回收核酸,仍有待用一些特殊的技巧对现行的有关方法加以改善。另外,对任何一个自然微生物群落的研究常常需要对其多个平行样品进行分析和统计,而目前而言要用核酸杂交技术分析如此众多的样品实际上相当困难。准确估算样品中有关基因的拷贝数的方法尚有待进一步建立。从诸如水样等样品中检测到以很低丰度存在的、或在整个微生物群落中仅占很小比例的微生物类群,核酸杂交技术的灵敏度尚需大幅度提高。而要将特定的微生物或核酸序列从富含与它亲缘关系较近的其它微生物的背景中检测出来,也要求一些特殊的方法。4　检测灵敏性和特异性的改善检测的灵敏度和特异性是限制核酸杂交技术在环境上被广泛应用的重要原因之一。改善和优化杂交分析的条件、采用不同的核酸探针、增加样品中靶序列的浓度等均可提高核酸杂交技术用于环境分析时的检测水平。而单链DNA和RNA探针可以在一定程度上提高[15]检测的灵敏度,因它们比双链DNA探针具有更高的特异性。最可能数目(most-proba2ble-number,MPN)DNA杂交技术可以通过增加携有靶序列的微生物的数量而提高检测水[18][19]平。许多研究者还建议通过增强探针信号或扩增靶序列拷贝数等以提高检测水平。目前已有许多加强杂交探针信号的方法被提出或申请专利,其中包括在每一DNA探针分子上同时标记多种酶、对每一靶序列用多种探针的组合以及利用二级探针与初级探针杂交并检测之等。而当寡核苷酸探针是以细胞内的rRNA为杂交目标时,用多个已标记的探针与16S和/或23SrRNA分子上的不同位点结合,能使目标细胞被更多的标记物所标记(即[20]多重标记),从而大大提高探针的灵敏度。另外,PCR技术已被大量应用于直接扩增环境样品中的靶序列。5　结论与前景从环境学的角度而言,应用核酸杂交技术的最终目的是了解微生物群落的结构、组成以及群落内单个种群或基因的动态,并利用这些信息进一步了解控制种群动态的机制并预知环境中某些特殊的活动或过程。核酸杂交技术与其它的分子技术结合,具备分析微生物多样性(在此之前受依赖于纯种培养的传统技术的严重制约)的巨大潜力。目前,核酸杂交技术已被广泛应用于微生物领域的研究,因为:①克隆、分离及扩增能用作探针的核酸序列的成熟技术的存在;②目标核酸序列可以被快速转移并固定于固相支持物上;③探针很容易被标记及检测。分离、鉴定和描述新的微生物种将是一项长期而艰巨的工作,而核酸杂交技术将是其中一种重要的工具。应用快速、简便和灵敏的核酸杂交技术,可以检测和定量研究环境中\n　第1,2期黄立南等:核酸杂交技术在微生物生态学上的应用119的核酸及其宿主微生物,研究自然群落中基因的转移和维持、基因工程微生物的影响和去向、甚至揭示新的生态现象等。利用核酸杂交技术还可以在原位研究微生物群落的组成及其不同个体在空间上的关系以及各种种群的功能等之间的联系。所有这些对于理解大多数的生物地化循环过程极为重要,因为其中的许多转化过程常常是由许多特定的微生物类群的组合而非单一物种所参与的。利用PCR,核酸杂交技术已被证实能有效检测和鉴定那些极低丰度的或者到目前为止还不能培养而常常被传统的鉴定技术所忽略的微生物类群。参考文献:[1]AMANNRI,LUDWIGW,SCHLEIFERKH.Phylogeneticidentificationandinsitudetectionofindividualmicro2bialcellswithoutcultivation[J].Microbiol.Rev.1995.59(1):143-169.[2]GIOVANNONISJ,BRISCHGITB,MOYERCL,etal.GeneticdiversityinSargassoSeabacteraplankton[J].Nature(London),1990,345:60-63.[3]WARDDM,WELLERR,BATESONMM.16SrRNAsequencesrevealnumerousunculturedmicroorganismsinanaturalcommunity[J].Nature,1990,345:63-65.[4]STALEYJT,KONOPKAA.Measurementofinsituactivitiesofnonphotosyntheticmicroorganismsinaquaticandterrestrialhabitats[J].NnnuRevMicrobiol,1985,39:321-346.[5]ROSZAKDB,COLWELLRR.Survivalstrategiesofbacteriainthenaturalenvironment[J].MicrobiolRev,1987,51:365-379.[6]SAMBROOKJ,FRITSCHEF,MANIATIST.MolecularCloning:Alaboratorymanual[M].NewYork:ColdSpringHarborLab,1989.[7]TILGHMANSM,TIENEIERDC,SEIDMANJG,etal.InterveningsequenceofDNAidentifiedinthestructuralportionofamouseB-globingene[J].ProceedingsoftheNationalAcademyofSciences(USA),197875:725-729.[8]SHAPIROJA.Mobilegeneticelements[M].NewYork:AcademicPress,1983.[9]WILLIAMSONVM,YOUNGET,GRIACYM.TransposableelementsassociatedwithconstitutiveexpressionofyeastalcoholdehydrogenaseⅡ[J].Cell,1981,23:605-614.[10]CHELMBK.DNA-DNArenaturationkinetics[A].In:EDELMANM,etaleds.Methodsinchloroplastmolecularbiology[M].NewYork:Elsevierbiomedical,1982.301-313.[11]BRITTENRJ,GRAHAMDE,NEUFELDBR.AnalysisofrepeationDNAsequencesbyreassociation[J].MethodsinEnzymology,1974,29:363-406.[12]TORSVIKV,GOKSOYRJ,DAAEFL.HighdiversityinDNAofsoilbacteria[J].ApplEnvironMicrobiol,1990,56:782-787.[13]CHELMBK.AnalysisofchloroplastDNAtranscriptionbyRNAdrivenhybridizationkinetics[A].In:EDEL2MANM,etaleds.Methodsinchloroplastmolecularbiology[M].NewYork:ElsevierBiomedical,1982.551-557.[14]SHARROCKRA,GOURSERL,NOMURAM.Inhibitoryeffectofhigh-leveltranscriptionofthebacteriophagelambdanutLregionoftranscriptionofrRNAinEscherichiacoli[J].JBacteriol,1985,163:704-708.[15]HOLBENWE,JANSSONJK,CHELMBK,etal.DNAprobemethodforthedetectionofspecificmicroorganismsinthesoilbacterialcommunity[J].ApplEnvironMicrobiol,1988,54:703-711.[16]SCHMIDTTM,DELONGEF,PACENR.Analysisofamirinepicoplanktoncommunityby16SrRNAgenecloningandsequencing[J].JBacteriol,1991,173:4371-4378.[17]LLOYD-JONESG,LAUPCK.AmolecularviewofmicrobialdiversityinadynamiclandfillinQuebec[J].\n120生态科学第20卷　FEMSMicrobiolLett,1998,162:219-226.[18]DRAKETA,HINDLERJA,BERLINGW,etal.RapididentificationofMycobacteriumaviumcomplexincultureusingDNAprobes[J].JClinMicrobiol,1987,25:1442-1448.[19]RATNERM.DNAprobes:Themarketversusthemagic[J].Bio/Technology,1988,6:1369-1370.[20]LEES,MALONEC,KEMPPF.Useofmultiple16SrRNA-targetedfluorescentprobestoincreasesignalstrengthandmeasurecellularRNAfromnaturalplanktonicbacteria[J].MarEcolProgSer,1993,101:193-201.UseofNucleicAcidHybridizationinMicrobialEcology122HUANGLi-nan,NIEXiang-ping,LANChong-yu(1.DepartmentofEnvirenmentalSciences,ZhongshanUniversity,Guangzhou510275,China;2.SchoolofLifeSciences,ZhongshanUniversity,Guangzhou510275,China)Abstract:Duetothefactthatmostofthemicrobialspeciesinnaturecannotbecultured,thetradi2tionaltechniquesbaseoncultivationandpure-cultureisolationhadbecomethemajorlimitationtothestudyofmicrobialecology.Advancesinmolecularbiologyprovideresolutionstothequestionsthathadhinderedthemicrobiologicalstudyforalongtime.Nucleicacidhybridizationhasgreatpotentialitiesandhasbeenwidelyappliedinthefieldofsystematictaxonomyandecologyofmicrobiology.Herewereviewedthebasicprinciplesofnucleicacidhybridizationanditswideapplication,majoradvantagesandlimitations,andhowtoimproveitsdetectingsensitivityandspecificity.Theapplicativeprospectofthistechniquewasalsodiscussed.Keywords:nucleicacidhybridization;microbialecology