分光光度法测定_淀粉酶活性_涂祖新

'o第五卷第四期江西科学V』服4ee。,一九八七年十二月JIAN(子XlSCIENCED1987一a分光光度法测定淀粉酶活性涂祖折周和山熊占(江西省科学院微生物研究所)一。,。,。。a一〔提要〕碘淀粉复合物的吸光度月与淀粉浓度呈直线关系沉粉经淀,。一粉酶37℃降解10min后用氛化铜/盆酸混合液中止反应测定碘淀扮复合物在sa一。580nm处的吸光度并根据公式R二(5/B)(1一Ax/月)来计算淀粉酶活性口1住=-71百,a一,:[’1、t乞]、目前淀粉酶活性测定方法有多种主要可分四类淀粉降解法还原法色素生成,召。”。I1和复合酶法[〕〔J法我国轻工部颁标准法是属于淀粉降解法类型它是通过定时从反应液,,用肉眼同标准色泽比较以确定反应终点,根据达到终点所需的反应时中取样稀碘液显色。,。间来计算酶活力因为该法是靠肉眼来判定反应终点所以可能造成一定的误差在实验室,。,内进行比较精细的分析需要一种更为严格的定量方法我们结合实验室工乍的需要建立a一。,了一种比较简便而又较精确的淀粉酶活性测定法其原理是碘与淀粉结合而显现的颜色随,。“一淀粉浓度提高而加深在一定条件下其吸光度(姓)与淀粉浓度呈直线关系淀粉经淀粉,。酶作用后经测定吸光度(几)来确定降解量并计算出酶活力一‘讨料与方法(一)仪器与试剂.:。1751G型分光光度计上海第三分析仪器厂生产.沙2.:.,2浓碘液](KI4%+104%)准确称取49碘化钾和。49碘先用少量蒸馏水,,。使碘完全溶解后再定容至1叨ml贮于棕色瓶内.。3稀碘液四1:用前取3ml浓碘液稀释至100ml.5:..一:aZ‘·4缓冲液‘1oZMpH6o磷酸氢二钠柠檬酸缓冲液称取磷酸氢二钠(NHPO1:.、。。7·:.,。211())45249柠檬酸(CH0HO)8079用蒸馏水溶解并定容至1oooml5.:u2·Z.:酶解反应终止液将10%氯化铜(CC1ZHO八日37%盐酸(HCI)按19的。比例混合.。:,6标准淀粉溶液(1o%)取可溶性淀粉(浙江菱湖化工试剂厂产品)于称量杯中5℃,,,,10烘Zh后精确称取29加少量缓冲液加热溶解至透明冷却后用缓冲液定容至。200ml。:。,。7膝液按具体情况用缓冲液稀释(或配制)成适当的浓度过滤去渣置4℃保存。木文于1986年12月30日收到 一分a光光度法测定淀粉酶活性。本试验用的酶干粉是赣南酶制剂厂产品一(二)碘淀粉复合物及稀碘液的吸光度(姓)曲线1%淀粉溶液sml,取加入缓冲液和终1ml,止液各用旋涡混合器混匀后从中取出二‘·“。2ml,。O用701稀碘液显色空白对照管以,。.sml缓冲液代替淀粉其余同上使用05。,751Gm光程的玻璃比色杯用型分光光度一计测定碘淀粉复合物在不同波长(几)处的。,吸光度(A)测定稀碘液吸光度(A)时,。以蒸馏水为空白对照结果见表1和图1,58On,由试验结果可知在m波长处碘一A)最大,淀粉复合物的吸光度(而稀碘液的吸光度。580nm来测(A)很小我们选择。定淀粉含量(三)淀粉浓度与吸光度(A)的关系5ml,在不同百分浓度的淀粉溶液中加。波长(1)入缓冲液和终止液各1ml混匀后分别取出一.,。n,图1琪淀粉复合物及稀腆液的吸光度曲线oZml用7ml稀碘液显色在ssom波长处。。按(二)的方法测定各管的吸光度(A)具体淀粉百分浓度及其对应的吸光度(A)见表2一表1碘淀粉复合物及稀碘液在不同波长处的吸光度。,入4404604805005205理05G0580600620660680700720740760780800一碘淀粉...,..。。。.........。7508609凌101Q了114121124123112O77069061053046038031025复合物}盆二二二二二老二二二二盗,一考任飞二二二忌二_二一了一二下一爷一吮~一入,。1400420440460480500520540一5605806一00620660········1‘“。“””45。“”。’6”“9。“5”。40。。。。。稀碘液{03002002001001表2不同淀粉浓度与吸光度的关系一(%)(m580)试管号淀粉浓度淀粉量g)吸光度(A0DO。。0150130。2lO0。26。。03l5039。。042OO51.。介5艺5O61。。0(33O0740.7350。87厂.。f840l00.45.09111·.11飞o,50‘123} ..1987428江西科学年第期,,由试验结果可知在本试验条件下淀粉量与其对应的吸光度(A)呈通过原点的直线。关系(见图2)(四)酶活力测定与计算·2.习1操作步骤·基二工用缓,冲液将酶稀释成适当的各种浓度。各取lml置不同编号的试管内标准管用。1ml缓冲液代替酶液置37℃水浴2mil,依次加入1.05ml,后37℃预热的%淀粉,n。立即混匀37℃准确反应zomi立即加入,、。1ml终止液混匀终止酶解反应反应液,o.降至室温之后取出Zml用7ml稀碘液显,。色测定各管的吸光度(A)2。酶活力计算,1在本试验条件下每分钟内能降解。mg淀粉的酶量定为一个酶活力单位(U)淀(mg)粉员1mg酶干粉所含有的活力单位数定为比活图2淀粉量与吸光度的关系。力(U/mg)因为淀粉量。(W)与其吸光度(A)成正比关系(见图2)x_s即:平W寿一不.,x=s所以WW五s(2)A式中,Wx为样品管中经酶作用后残留的淀粉量;Ax为样品管的吸光度,万s为标准管中的‘。,As淀粉量为标准管的吸光度5ml1.0,因为酶解前样品管内淀粉量为%的淀粉(即50mg)所以淀粉降解量为50一W二<,:mg)则该样品管内酶的活力单位(U)为xA.s.50一Wu二A。丝上卫玉(3)10l0:该酶的比活力(R)为xA.50一W5=卫&(u/mg)R(410xB,;。式中10为酶解反应时间(min)B为样品管中酶量(mg),4):本试验中标准管的淀粉量亦为50mg所以(式可简化为R=(5/B)(1一AxA:)(U/mg)(5)/ 一分光光a度法测定淀粉酶活性结果与讨论“一,。我们用上述方法对赣南酶制剂厂生产的淀粉酶活性进行了测定结果见表3酶量与吸光度(A)的关系见图3表3不同酶浓度与比活力的关系‘U,试管号酶浓度(%)酶量(B)(mg)!坐兰里竺巡巨竺鲤⋯比活力(R)(U/mg)..。24;。2.,曰Q自曰任,COJ,人块1‘幼八U峨1三OC八J任OC内J1n1U日nCUn八UConO,曰1nUL0nnUb今一b皿匀n,020}..。..0181028}385一。···⋯⋯016,032”69{..,.01404336。··。012“48“03253一。。丹O内O六内。0572660曰今口曰,曰O‘t七bl010.。。0。08071209,。。。几J丹006082164⋯b。··004{096rl07..。10905310002标准管003和图3可,从表以看出酶浓度只有在·一,’2定的稀释范围内酶量与淀粉降解量才皇万.1。:,测得的比活力才准确因而在使云直线关系之口.:。用本方法时,首先要进行初步试验,奋确定酶。。的浓O9度范围0.,一8在实验中我们注意到温度对碘淀粉,9℃复合物吸光度有影响如同一种样品在..。八曰自UcnOo沙一卜亡J性八d一1J,=2330;15℃,=1244时A而在时A因而,本方法要求每次都需在同一温度下测。⋯:标准管的吸光度(A)以保证实验的准确n,由于本试验酶解反应时间固定为10mi这就需要在酶解反应后立即有效地终止酶反。。应用加热或加酸可以使某些酶失活但是a一IFFlloo8Oa一有些淀粉酶(如产生的淀粉今公J奋(幻1弓酶)用加热或加酸的方法均不能有效地终止。图3酶量与吸光度的关系酶解反应我们用硫酸铜溶液和盐酸溶液混,。,,合作为终止液结果很佳加入终止液后的酶解反应液在48h内取样显色其吸光度均稳。定不变上面介,a一,绍的方法用精密光学仪器来定量测定淀粉酶的活性酶的活力单位以淀粉降,。a一。,操作简便解量直接表示结果精确本方法可用于实验室及工厂检测淀粉酶活性 ..1987430江西科学年第期参考文献。。.1〕Sree,..anose,..neeta,1(1956)256268ttHVdClJRCliChmA一!、2〕aous,。:ean。。n.a。nves.,。DhlitASdJCliLbIt14(1962)145一151esa,.,ra,.anron,.:n.e.ca,f3〕CkMBithKdBwBCliChmAt26(1969)。437一444l,。。.。,。.吸尸注尸七rdb月通亡八J、沪.JMarshallJJ:ClinChem25(1979)1675一1680,7.《中华人民共和国轻工业部部颁标准》QB47一80(1981)ansen,..:na。e.ea,.HpWAlChmAt155(1954)375一377DETERMINATIONOFa一AMYLASEBYSPECTROPHOTOMETERuoxn,ouoshanandXio九9ZanTZiZhH(InstituteofMerooogy,angxeaeoeeneesibilJiiAdmyfSi)ABSTRACTereaonseeeneasoranee。。o,。oeo一sareanThltihipbtwthbbAfthidinethd。theeonsisteneeofthestareh15astraightlineThestareh15degradedbya一aaseat37or10minute,aneegraaton5stoppeangmyl℃fdthddi1dbyddiu:eoexsouon.eeernaonoa一a5CCI/HCImplltiThdtmitifrnylase1measuredytheabsorbaneeofone一stareat580naneorua:bidihmdthfml。R=(5/B)(1一AxAs)/拱狱狱狱报数奈裁狱摧狱报奈狱奈狱奈报奈裁数报条搽获获栽奈数条戮数狱戮数戮戮奈娥奈获狱裁狱撅条报数器条撅戮数戮获联条猫条聚祭奈条聚祭撇鞭撇器黔器兴聚撇·敬告作者·《江西科学》对来稿有新的要求《江西科学》为全国公开发行的学术刊物,198861决定自年第卷第期起使用,,关键词请广大作者今后来稿时务必提供3一5个中英文对应的关键词分别列中英,。文提要之后关于来稿的其他要求请参见封三稿约戮条条叛黯撇默黯叛兴黯襄黔聚数奈兴黯叛鞭撇米条茉聚寨兴聚撇兴条黔撇叛叛黯条聚条米戮来柴条兴'