EM菌处理垃圾渗滤液的微生物生态学及机理分析研究-论文

第39卷第8期环境科学与管理VoL39Nn82014年8月ENVⅡtoNM[ENTALSCIENCEANDMANAGEMNTAug．2014文章编号：1674—6139(2014)08—0065—06EM菌处理垃圾渗滤液的微生物生态学及机理分析研究裴廷权，梅峰(深圳市深港产学研环保工程技术股份有限公司，广东深圳518057)摘要：通过DNA提取，PCR扩增和DGGE分离，用BLAST程序进行相似性比较分析体系中微生物群落多样性。所有序列与数据库中16SrDNA序列的相似性在94％一100％之间。从整个挂膜过程考虑，挂膜时间应在8天左右。渗滤液中污染物的去除与投加EM有很大的关系，但是渗滤液中原始茵种的贡献同样不可忽视。投加EM茵剂促进了渗滤液中群落结构演替和功能优化，并最终通过EM茵剂和渗滤液中原始茵群的共同作用实现渗滤液处理系统效能提高和完善。关键词：EM；垃圾渗滤液；生态学；分子生物学技术中图分类号：X703．1文献标志码：AMicrobialEcologyandMechanismofLandfillLeachateTreatmentwithEMPeiTingquan，MeiFeng(Shenzhen—HongkongInstitutionofIndustry，Education＆ResearchEnvironmentalProtectionEngineeringTechnologyCo．，Ltd，Shenzhen518057，China)Abstract：ThroughDNAextraction，PCRamplificationandDGGEseparation，thispaperHsesBLASTprogramtoanalyzethemicrobialcommunitydiversityofthesystem，aswellasthedynamicchangeofdifferentcommunitiesintheprocessofbiofilmform—ing．Theresultshowsthatthesimilarityofallsequenceand16SrDNAsequenceinthedatabaserangesfrom94％to100％．bio—filmtimeshouldbe8daysapproximatelyfromthewholeprocess，theleachatewascloselyrelatedtotheamountofEMadded．However，thecontributionoforiginalstraininleachatecannotbeignoredpartofinthecommonfunctioncomefromtheEMstrainsandleachateitselfrole．ThemedicamentofEM，basedonitsownfunctions，mayenhancethestructuralevolutionandfunctionsofthecommunities，betterthetreatmentsystem，andfinallythroughtheEMmedicamentandleachateinthejointactionoftheoriginalfloraleachatetreatmentsystemstoachieveincreasedperformanceandimproved．Keywords：EM；landfillleachate；ecology；molecularbiologicaltechnology随着中国经济的发展和城市人口的增加，城市毒有害物质_4J，若不加以处理则会对周边生态环境生活垃圾产生量日益增加。目前，卫生填埋仍是造成极为恶劣的影响J。因此，垃圾渗滤液的污中国城市生活垃圾处置的主要方式。垃圾填埋染控制和治理已成为当前环保领域内的一项重大场产生的渗滤液成分复杂、可降解性差、含有大量有课题。PCR—DGGE作为一种指纹分析技术，具有可靠收稿日期：2014—06—13性高、快速、稳定性强等特点，广泛应用于微生物种群基金项目：广东省深圳市科工贸信委的基础研究项目(项目编号：多样性和种群结构变化J，但对渗滤液处理系统中微JC201005180676A)，重庆市建设委员会资助项目(城科生物种群多样性和动态变化的研究报道尚不多见。2007—22)作者简介：裴廷权(1980一)，男，博士，高级工程师，主要从事污水处所用EM菌剂经过长期演替过程而适生的优势群落，理与资源化利用研究工作。·65·\n期裴廷权等．EM菌处理垃圾渗滤液的微生物生态学及机理分析研究V01．39No．8Aug．2014所含营养物质丰富，为微生物的生长提供了更为广泛1．2．416SrDNAV3区的PCR扩增的基质。通过分子生物学技术分析投加EM菌剂对将提取的渗滤液转移至EP管中，10000r／min菌群结构所产生的影响，掌握微生物菌群动态演替规离心5min，去上清，沉淀用Axygen细菌DNA提取律，分析在不同条件下微生物的群落结构及作用试剂盒提取总DNA。PCR采用501~L反应体系，在机理。2％的琼脂糖凝胶上电泳。1．2．5PCR产物的DGI分析1材料和方法16SrDNAV3区的PCR扩增产物浓缩后，采用1．1样品采集与来源DGGE分析系统进行电泳分离，用菌落PCR方法检所采渗滤液来自重庆某垃圾填埋场，下列样品测阳性克隆。阳性克隆子送上海生工生物技术公司为混合后样品。样品分为挂膜前的空白样和不同挂进行测序。测序结果于NCBI上一次性提交到基因膜阶段的样品，参与分子生物学分析的样品见表1。数据库进行BLAST比对分析并获得序列号。(见图表1分子生物学的样品1、图2)校非媒1．2试验方法1．2．1EM菌挂膜600bp500bp挂膜期：向1L烧杯中加入的400mL渗滤液，300bp3o0bp调节pH值至8．5，按照EM与水体积比为1／10000200bD的接种量投加EM菌液，充分混合均匀后向反应器100bp中进水。曝气采用低流量间歇曝气，每天上午、下午各曝气2h，每隔72h换1次水，每次约进水量的1／图1微生物的DNA扩增图3。每隔48h补加因换水流失的EM菌液，EM补加量为初始EM投加量的1／3左右。运行期：系统挂膜成功后，重新进水(pH=8．5)运行，每天上午、下午各低流量曝气2h。1．2．2DNA的纯化采用上海生工的DNA凝胶回收试剂盒，粗提的DNA经普通DNA纯化试剂盒纯化以后，在其纯化产物中加入终浓度为0．5Ixg·mL核糖核酸酶(RNaseA)。并在37℃下水浴消化2h，用来去图2DGGE图谱中的条带数除RNA。2结果与分析1．2．3优势茵的16SrRNA的扩增以优势菌单菌落的菌悬液为PCR扩增模板，以2．1细菌16SrDNAV3区的PCR扩增16SrRNA的通用引物进行菌落PCR扩增。正向引将提取的DNA用于l6SrDNAV3区特异性片物27F(5一AGACrITITGATCCTGGCTCAG3)和反向段PCR扩增，扩增产物用2％的琼脂糖凝胶电泳检引物1492R(5TACGGTrACCTTGrIfrACGACm)，验，拍到的细菌16SrDNAV3区的PCR扩增产物的筛选阳性克隆进行测序。电泳状况如图1所示，PCR扩增获得了高特异性的．66·\n期裴廷权等．EM菌处理垃圾渗滤液的微生物生态学及机理分析研究V01．39No．8Aug．2014PCR产物，左边第一个是比对柱，接下来依次为本2．3变性梯度凝胶电泳分析次试验的样品号，左边一号柱(比对柱)扩增片段共DGGE电泳图(如图3所示)分析表明，第A1有600bp，而通过引物进行PCR扩增得到16SrDNA泳道的3，4，5号条带宽而明亮，在整个样品A1中是V3区序列，扩增所产生的6个DNA片段为单一条绝对的优势种群。样品A2(渗滤液原始菌试验)共带，片段大小约为210bp，符合目标片段长度。均在有10个条带，从优势种群的条带上看，明显不如A1比对柱600bp以内，表明扩增产物没有明显非特异样品宽和亮，说明优势种群的方面远不及所投的EM菌。样品A1和样品A2有很多共同部分但也有性扩增现象。所差异，表明EM菌群与渗滤液原始菌群是存在交2．2DGGE图谱相似性Cs值分析集的两个菌种群落。在投菌挂膜的第2d，样品A3用BLAST程序进行相似性比较分析，所有序列在反应体系中的条带数量不及样品A1和A2。在反与数据库中16SrDNA序列的相似性在94％～应的初始阶段，由于有些优势菌种不适应反应提供100％之间。泳道间相似性系数cs值不同，说明反的环境或适应环境需要一定的时间，菌种的活性还应器内微生物多样性和种群结构产生了较大的变未得到充分发挥，主要是EM菌中的5号条带代表化。A1样品代表的是在挂膜前所投的EM菌，A2的菌属充当着主导作用。所投EM和渗滤液自身的样品代表的是渗滤液中自身的土著菌种，由图2可4号条带代表的菌也发挥了重要的作用至挂膜第知，在挂膜成功后A1样品中EM菌稍微比A2样品6d，在5号条带代表的优势菌发挥主导地位的同要丰富。在挂膜的开始阶段，由于所投EM菌适应时，一些新的优势菌种开始发挥作用，4号条带代表环境需要一定的时间。在挂膜的前2d，整个反应体的菌种活性得到了加强，7号和14号条带也明显变系中菌种代谢与消耗，菌种数变化不大。在反应的亮，但像6号和8号条带逐渐消失，这说明部分原始开始阶段(挂膜前6d)，反应体系中以渗滤液中自菌群无法适应环境的变化而逐渐减少。身的菌种为主。随着挂膜时间的延长，体系中的优A1A2A3A4A5^6势菌种发生了很大的变化，原来投加的EM菌中的S1·—一S2S3优势菌功能逐渐显示出来，在挂膜的第8d左右，系．．卜—一S6S4S5统中的菌种数量达到最多，体系中的菌种处于相对S7S8稳定的时期，Cs(A4一A5)达到了95．7。多种菌种S9—————--共同发挥出自身的生物活性，在去除污染物方面往S10--——-——往效果比较好。如果再延长挂膜时间，到挂膜的11Sll。。。’。’d左右，由于生物菌种不断的反应消耗和代谢作用，S13——-——-—{··-———一$12菌种的生物降解活性逐渐下降。因此，从这个方面考虑，前期的生化挂膜时间应控制在8d左右。(见—··---·——一S14S15—--————{．-表2)$16--———-—_—_}—————一S17表2不同挂膜条件下DGGE图谱相似性矩阵图3PCR产物的DGGE图谱第A1泳道的3，4，5号条带宽而明亮，在整个样品A1中是绝对的优势种群。样品A2(渗滤液原始菌试验)共有10个条带，从优势种群的条带上看，明显不如A1样品宽和亮，说明优势种群的方面远不及所投的EM菌。样品A1和样品A2有很多共同部分但也有所差异，表明EM菌群与渗滤液原始菌群是存在交集的两个菌种群落。在投菌挂膜的第．67·\n期裴廷权等．EM菌处理垃圾渗滤液的微生物生态学及机理分析研究Vo1．39No．8Aug．20142d，样品A3在反应体系中的条带数量不及样品A1条带S3代表的菌种与Uncuhuredbacteriumclone和A2。在反应的初始阶段，由于有些优势菌种不适BL33同源性为100％，菌株Unculturedbacterium应反应提供的环境或适应环境需要一定的时间，菌cloneBL33存在于EM菌和渗滤液中，是严格意义种的活性还未得到充分发挥，主要是EM菌中的5上的好氧菌，具有很强的适应能力。号条带代表的菌属充当着主导作用。所投EM和渗条带s4代表的菌种与UnculturedFirmicutes(厚滤液自身的4号条带代表的菌也发挥了重要的作壁菌门)bacterium同源性为99％，UnculturedFirmi—用。至挂膜第6d，在5号条带代表的优势菌发挥主cutesbacterium菌株是挂膜成熟期最主要的优势菌导地位的同时，一些新的优势菌种开始发挥作用，4种，在挂膜的第11d，该菌株的数量大大减少，优势号条带代表的菌种活性得到了加强，7号和14号条地位减弱。条带s5代表的菌种与Pseudomonassp带也明显变亮，但像6号和8号条带逐渐消失，这说(硝基苯酚降解菌)同源性为99％，属于革兰氏阴明部分原始菌群无法适应环境的变化而逐渐减少。性。条带s6代表的菌种与Sulfide—oxidizinghaete．到了挂膜第8d左右，样品的条带数量和种类riumISW一10(硫氧化菌)同源性为97％，存在于渗与前阶段基本相当，在一定程度上，表明此期间是相滤液中，环境适应能力差，反应刚开始就被淘汰。条对稳定的阶段。优势菌的地方发生了根本性的改带s7和S11代表的菌种与UnculturedFirmicutes变，4号条带变得非常亮，其代表的是适应性较强的bacterium、Pseudomonassp．108Z1同源性分别为优势种群。该菌种随着挂膜时间的延长而逐渐生长95％98％，其中条带s7代表的菌种是渗滤液的原和壮大，并随运行时间逐渐趋于丰富和稳定，在样品始菌株，而S11代表的菌种为EM菌中的菌株，Firm—中的优势地位非常明显。14号条带代表的菌种也icutesbacterium呈革兰氏染色反应阳性，菌体有球发挥了比较重要的作用，5号条带代表的微生物优状、杆状或不规则杆状等，是化能营养型，对COD的势种群逐渐消失，同时增加了一些新的优势菌群，比去除有很大的贡献，在优势菌中充当着重要的作用。如17号条带就代表的某种新的优势菌。随着反应条带S10和S16代表的菌种与Alkaliphilussp的继续进行和环境的改变，种群数量明显降低，仅剩同源性均为99％，存在于渗滤液中的菌株。条带下6个优势菌种，并且条带的亮度暗了很多，说明这$10代表的菌种适应能力很差，很快就消失了。条些菌种数量急剧下降。其中条带3、4、5、l4号一直带S16代表的菌株在整个反应器中充当着一定的优出现在挂膜的第6—11d，说明这些条带代表的菌种势菌株。条带$12代表的菌株与Clostridium(梭状已经适应现有的环境，不同运行时期这些菌种群落芽孢杆菌)speciesstrainPO同源性为99％，是存在具较高程度的稳定性，是处理渗滤液中污染物的优于渗滤液中的菌株，为厌氧性革兰氏阳性杆菌，在挂势菌。膜的整个过程中是好氧环境，所以该菌株的种群优2．4同源性分析势不及其它菌株。条带S13和S14代表的菌种与将序列信息提交到GenBank数据库用BLASTBacteriumenrichmentcultureclonedylF86，Thermace—进行检索与相似性分析，比对结果见表3。投加EMtogeniumsp．Sp3同源性均为100％，存在于EM菌菌后，原有的渗滤液中微生态系统发生了很大的改中，属于热气单胞菌属。条带S14代表的菌种在挂变，优势种群组成更加合理、功能得到强化，由此带膜的第6～11d，一直充当着重要优势菌的角色，在来处理效果的提升。条带S1与数据库中菌株Tis．污染物去除方面贡献不少。条带$15代表的菌种与sierella(组织菌属)sp．ultureclonedylF19的16SrD-Tepidibactersp(八叠球菌属)B116SribosomalRNANA同源性为98％。Tissierellasp属于杆菌的一种，gene为98％，该条带在泳道显示很暗，说明该菌株随着运行时间的延长，但该菌株的适应能力差很快在体系中的优势地位不显著，在挂膜的前8d，该菌被淘汰。条带S2代表的菌种与Enterococcussilesia．种优势地位发挥的作用一般，但在挂膜第11d，由于CUSstrain同源性为96％，在挂膜过程中，一直充当该菌株的代谢活性减弱，慢慢就被其它的优势菌株着优势种群的作用，对污染物的去除有很好的作用。所取代。(见表3)．68·\n嘉期裴廷权等．EM菌处理垃圾渗滤液的微生物生态学及机理分析研究VoA1．u3g9．N2。o．1：渗滤液中污染物的去除与投加EM有很大的关中，在挂膜反应期间，保持着很好的种属优势且稳定系，投加EM菌剂使渗滤液中原有的微生物生态环性强，说明这两种尚未明确的细菌在去除污染物方境发生了根本性的改变。条带$14代表的菌株存在面发挥着重要的作用。而Enterococcussilesiacus于EM中，在挂膜成功后一直保持稳定的状态，说明strain、UnculturedFirmicutesbacterium、Thermaeetoge—条带S14对应是菌株在整个系统中处于优势菌种的niumsp．Sp3的序列很近，有较好的亲缘关系。地位。条带s3、S4代表的菌种在优势种群方面也非常突出，说明在去除渗滤液中污染物方面，投加EM菌剂对污染物的去除有重要的贡献。而单独源于渗滤液原始菌群的S7菌也是挂膜成熟期菌落的重要组成，渗滤液中自身的菌种对污染物的去除也有着重要的作用。2．5优势条带序列系统发育树从GenBank得到与其同源性最近的序列，用MEGA4中的Clustal软件对GenBank中比对得到的同源性最高的序列进构建系统发育树，各菌种的系dItI^●b·Ict●flu-‘，J●82o25．1)统发育地位见图4。条带sl代表的菌种存在于EMb●t^plrot●ob删L'．●_‘^B5off日B．1)菌中，在同源性分析中和系统发育树上保持在很好_f-p(GQ23lg1●．1)的一致性，与ClostridiumspeciesstrainPO存在较好的亲缘关系。条带s2和S14代表的菌种虽在序列矗-一i————距离很近，但在系统发育树上没有找到与其亲缘关图4由DGGE测序结果建立的系比较近的种。而这两种细菌主要存在于EM菌16SrRNA基因的系统发育树·69·\n嘉期裴廷权等．EM菌处理垃圾渗滤液的微生物生态学及机理分析研究V01A．u3g9．N20o．184由图4可知，反应器中大部分菌种与Uncuhured的关系，但不可忽视的是渗滤液中自身菌种的贡献。Firmicutes有同源关系，而条带S4代表的菌种主要投加EM菌剂促进渗滤液中群落结构演替和功能优存在于EM中，与UnculturedFirmicutes同源性为化，充分发挥渗滤液中自身的菌种的功能，实现渗滤99％。因此，条带S4代表的菌种属于大体系菌门，液处理系统效能提高和完善。在整个挂膜过程中，始终担当着去除污染物的重要角色。条带s5、S17、S6代表的菌种在序列距离很参考文献：近，亲缘关系较好，但在系统发育树上没有找到与其[1]刘子旭，孙力平，李玉友，等．UASB启动及不同HRT亲缘关系比较近的种。条带s5代表的菌种在EM对老龄垃圾渗滤液处理效果的影响[J]．环境工程学报，优势菌中数量最多，适应环境能力强，在去除污染物2013，7(2)：483—488．[2]孙雨清，赵俊．垃圾渗滤液反渗透浓缩液处理技术方面具有显著的效果。条带S8、S9代表的菌种主要综述[J]．山西建筑，2013，39(11)：194—196．存在渗滤液中，前者代表的菌种与Pseudomonassp．[3]毛庚仁，张涌新，文雯，等．我国城市生活垃圾处理91S1保持很好的亲缘关系，后者代表的菌种与Un—现状及焚烧法的可行性分析[J]．城市发展研究，2010(9)：culturedbacteriumcloneC20—18保持很好的亲缘关12—16．系。条带$10代表的菌种与Tepidibactersp、$16代[4]李亚峰，杨严，王建．PAC和PAM复合混凝剂处理垃表的菌种序列距离很近，存在较强的亲缘关系。条圾渗滤液的试验研究[J]．工业安全与环保，2011，37(10)：9带S7、S12代表的未知菌种在挂膜后期仍然发挥出—11．较强的生物活性。[5]刘风华，宋永会，曾萍，等．厌氧出水培养好氧颗粒污泥及其微生物多样性分析[J]．环境科学与技术，2014，373结论(1)：70—74．(1)用BLAST程序进行相似性比较分析，所有[6]武俊瑞，岳喜庆，石璞，等．PCR—DGGE分析东北自然发酵酸菜中乳酸菌多样性[J]．食品与生物技术学报，序列与数据库中16SrDNA序列的相似性在94％一2014，33(2)：127—130．100％之间。由于EM菌的加入，反应器中形成新的[7]彭永臻，宋燕杰，刘牡，等．晚期渗滤液短程生物脱复杂微生态环境，从整个挂膜过程，挂膜时间应在8氮的实现[J]．土木建筑与环境工程，2012，34(6)：126—131．天左右。[8]MohajeriS，AzizHA，isaMH．Statisticaloptimiza-(2)EM菌的加入改变了渗滤液中微生物原来tionofprocessparametersforlandfillleachatetreatmentusinge—的群落结构。S4号条带变得非常亮，适应性强的微lectro—Fentontechnique[J]．JournalofHazardousMaterials，生物生存下来，并随运行时间逐渐趋于丰富和稳定，2010(176)：749—758．是最大的优势菌，与UnculturedFirmicutesbacterium[9]于宗灵，王锐，田宇哲．PCR—DGGE技术在废水生同源性为99％。物处理中的应用研究[J]．环境科学与管理，2013，38(9)：115(3)渗滤液中污染物的去除与投加EM有很大—1】7．·7O·