第十三章紫外——可见分光光度法

'第十三章紫外——可见分光光度法电磁辐射按其波长可分为不同区域。γ射线5～140pmX射线10-3～10nm光学区10～1000μm紫外10～380nm可见光380～780nm红外0.78～1000μm微波0.1mm～1m无线光波>1m 光学分析法的类型光谱法分子光谱、原子光谱发射光谱、吸收光谱、荧光光谱、拉曼光谱等非光谱法 §1基本原理一、分子能级(量)与电磁辐射二、光的性质三、物质的颜色与光的关系四、物质吸收光的定律 一、分子能级(量)与电磁辐射分子的能量包括：价电子能量（Ee）1～20eV分子内原子在平衡位置的振动能量（Ev）0.025～1eV分子绕重心转动的能量（Er）小于0.025eVE=Ee+Ev+Er分子吸收光谱的特点：带状光谱 二光的性质单色光：只有一种波长的光复合光：由两种及两种以上波长的光组成的光白光：红、橙、黄、绿、青、蓝、紫等颜色的光按一定比例混合而成互补色光：两种颜色的光按这一比例混合也可得到白光 白光绿紫橙青蓝黄青蓝红 物质的颜色吸收光颜色波长/nm黄绿紫400～450黄蓝450～480橙绿蓝480～490红蓝绿490～500紫红绿500～560紫黄绿560～580蓝黄580～600绿蓝橙600～650黄绿红650～700 三、物质的颜色与光的关系物质的颜色由物质与光的相互作用方式决定1.全吸收物质显示黑色，如金属粉末；2.全透射物质显无色，如水、无色溶液、无色玻璃等；3.全反射物质显示银白色，如银等金属；4.漫反射物质显白色，如碳酸钠、氯化钠粉末；5.部分吸收部分透过物质呈现吸收光的互补色。硫酸铜溶液吸收黄色光而呈蓝色；高锰酸钾溶液则吸收绿光而呈紫红色。 四、物质吸收光的定律——朗伯—比耳定律1、吸收曲线 2、朗伯—比耳定律设入射光强度为I0，透过光强度为I，溶液浓度为c，液层厚度为b，它们之间的定量关系表示为 当c的单位为g·L-1，b的单位为cm时，k称为吸收系数（absorptioncoefficient）以a表示。 若c的单位为mol·L-1，b的单位为cm，k称为摩尔吸光系数（molarabsorption）以表示。 与a的关系为ε=Ma 例13-1浓度为5.0×10-4g·L-1的Cu2+溶液，用双环乙铜二胺显色后，于波长600nm处，以2.00cm比色皿测定透光度为50.1%，求吸光系数和摩尔吸光系数。解：已知T=50.1%，则b=2.00cmc=5.00×10-4g·L-1M(Cu2+)=64.0g·mol-1则 3、偏离朗伯—比耳定律的原因物理原因：单色光不纯所致化学原因：溶液浓度高于0.01mol·L-1介质不均匀如呈胶体、乳浊、悬浮状吸光微粒发生解离、缔合、互变异构等 §2分光光度计及测定方法光度分析按照使用的光源及仪器又可分为目视比色法光电比色法分光光度法 一、分光光度计1、分光光度计的基本构造光源单色光器吸收池检测器显示器 光源（lightsource）：钨灯（6～12V），产生320～3200nm的连续光谱，其适宜的波长是360～1000nm。氢灯发射150～400nm波长的光，适用于200～400nm波长范围。辅助设备聚光透镜、稳压电源 单色器（monochromator）：作用复合光分解成按波长顺序排列的单色光组成入射狭缝、色散元件、准直镜。色散元件类型棱镜和光栅棱镜材料玻璃棱镜、石英棱镜玻璃棱镜的色散波段在360～700nm石英棱镜的色散波段在200～1000nm光栅做色散元件的特点：工作波段范围宽、适用性强、对各种波长色散率几乎一致。 吸收池（absorptioncell，比色皿）：材料无色光学玻璃、熔融石英形状长方形规格0.5cm、1cm、2cm、3cm和5cm要求相同规格的两个吸收池的透光度相差应小于0.5%注意事项保持透光面干燥、洁净，不可用手直接接触、不能磨擦透光面 检测器（detector）：作用透射光信号转换成电讯号。要求灵敏度高、响应时间短、响应的线性关系好等，不同波长的光具有相同响应类型光电管、光电倍增管显示器（display）：作用显示和记录检测器的电信号类型微安表、数码显示管标尺透射比（T）、吸光度（A） 2、常用的分光光度计分光光度计的类型单波长、双波长。单波长分光光度计又分为：单光束和双光束两种。单波长单光束分光光度计结构简单、使用方便，如721型、751型 721型分光光度计工作波长范围360～800nm结构光电管、晶体管放大线路和微电流表直读特点在可见光区灵敏度和稳定性比较好 751—G型紫外—可见分光光度计适用波长范围200～1000nm 二、分光光度测定方法标准曲线法A0C §3显色反应及其影响因素有色物质在其最大吸收波长处，测量吸光度灵敏度高无色或浅色物质先显色后测定显色反应的类型螯合、氧化还原、、生化 §3显色反应及其影响因素一、显色反应的要求1、反应定量完成2、选择性要好3、灵敏度要高4、有色物质稳定性好二、显色反应条件的选择 二、显色反应条件的选择1、显色剂的用量 2、溶液的酸度 3、显色时间4、显色温度 §4测量误差与条件的选择一、读数误差微分后得变形或T=36.8% 相对误差小于4%时透光率65～15%吸光度0.2～0.8 二、偏离吸收定律引起的误差1.单色光不纯的影响2.溶液的性质3.仪器误差4、测量条件的选择（1）入射光的波长（2）吸光度范围（3）参比溶液 §5紫外—可见分光光度法应用实例一、单组分含量测定二、多组分含量测定三、配合物组成的测定四、定性分析 一、单组分含量测定定量方法：根据朗伯—比耳定律关系式计算标准曲线法1、1,10-邻二氮菲法测定微量铁显色剂1,10-邻二氮菲是有机配位剂之一。配位比3:1最大吸收波长=512nmε1.1×104L·mol-1·cm-1。酸度范围pH为3～9，醋酸缓冲溶液pH=4.5～5.0还原剂过量盐酸羟胺测定铁含量0.5～8μg·mL-1 2、磷钼蓝法测定全磷样品处理浓硫酸或高氯酸H3PO4＋12(NH4)2MoO4＋21HNO3＝(NH4)3PO4·12MoO3＋12NH4NO3＋12H2O以还原剂如抗坏血还原酸磷钼黄杂多酸为磷钼蓝最大吸收波长660nm 3、土壤中氮含量的测定（1）铵态氮奈氏试剂处理，在490nm处测定线性范围为0.5～16μg/mL（2）硝态氮用酚二磺酸比色法在420nm下测定，线性范围0.05～9μg·mL-14、谷物蛋白质的测定5、植物样品中可溶性糖的测定6、酶活性测定 二多组分的测定1、吸收峰互不重叠2、吸收峰相互重叠 三、配合物组成的测定1、摩尔比法2、连续变化法'